Papel de los ácidos nucleicos citoplasmáticos de los baculovirus en la producción de IFN-I en células no inmunes de mamífero

Abstract

El baculovirus AcMNPV es un virus envuelto, con genoma DNA de doble cadena, patógeno de insectos. Posee un complejo ciclo de replicación bifásico en el que participan dos fenotipos: los virus brotados (BV) y los virus derivados de los cuerpos de oclusión (ODV), los cuales son estructural y funcionalmente distintos. Los BV son capaces de transducir genes bajo la regulación de un promotor adecuado en células de mamífero, aunque no pueden replicar su genoma en este hospedador. Dentro de las aplicaciones de los baculovirus como herramienta biotecnológica en mamíferos, se destacan su uso para el desarrollo de vacunas, para el delivery de genes y como inmunomoduladores. Se ha descripto una potente respuesta inmune innata inducida por BV en mamíferos, capaz de montar un estado antiviral inespecífico por vías independientes de TLR. Así, este trabajo de Tesis tiene como finalidad estudiar la participación de los ácidos nucleicos baculovirales citosólicos en la producción de un estado antiviral en células no inmunes de mamífero. En primer lugar, mediante ensayos de transcripción con baculovirus recombinantes se demostró que el citoplasma es el principal destino que alcanza el genoma baculoviral en distintos tipos celulares no inmunes. A continuación, se observó que los BV -pero no los ODV- son capaces de producir un estado antiviral y un aumento de IFN β en fibroblastos murinos. Además, se determinó que baculovirus pseudotipados con la proteína G (VSV) ingresan a la célula de manera más eficiente pero no producen mayores niveles de IFN β. Finalmente, se estudió la participación de distintos sensores citosólicos de DNA en células murinas y en células humanas infectadas con BV y se observó que la enzima RNA Pol III no está relacionada en el establecimiento del estado antiviral. La vía cGAS-STING en células murinas fue estudiada mediante edición génica por CRISPR-Cas9, mientras que en células epiteliales humanas se estudió mediante transcomplementación de cGAS o cGAS y STING en las células HEK293 y HEK293 T, respectivamente. Los resultados mostraron que STING es una proteína necesaria para el establecimiento de un estado antiviral en células de mamífero. Además, al menos dos vías de señalización distintas impactan en STING y contribuyen al estado antiviral por baculovirus. La detección del genoma viral por el sensor cGAS induce la respuesta celular más potente y es necesaria para la producción de IFN β. Además, la activación de STING, de un modo cGAS independiente, da lugar a un estado antiviral en el cual, en células epiteliales humanas, participa la producción de IFN λ1. En conclusión, los resultados de esta Tesis muestran que el genoma del baculovirus AcMNPV disponible en alta proporciones en el citosol en el contexto de infección de células no inmunes de mamífero, desempeña un papel relevante en el establecimiento de un estado antiviral y en la producción de IFN I y III a través del impacto en la vía de reconocimiento de ácidos nucleicos cGAS-STING.

The baculovirus AcMNPV is an enveloped virus with a double-stranded DNA genome and is a pathogen of insects. It possesses a complex biphasic replication cycle with two phenotypes involved: budded virus (BV) and occlusion-derived virus (ODV), which are structurally and functionally different. The BV is capable of transducing genes under the control of an adequate promoter in mammalian cells, although it cannot replicate its genome in this host. Among the applications of baculoviruses as a biotechnological tool in mammals, is worth mentioning their use for vaccine development, gene delivery and as immunomodulators. A strong innate immune response induced by BV in mammals has been described, and it is capable of inducing an unspecific antiviral state, independent of TLR pathways. Thus, this thesis aims to study the role of baculoviral cytoplasmic nucleic acids in the production of an antiviral state in non-immune mammalian cells. First, transcription assays with recombinant baculovirus showed that cytoplasm is the main destination reached by baculoviral genome in different non-immune cell lines. Next, it was observed that BVs -but not ODVs- are capable of producing an antiviral state and an increase of IFN β in murine fibroblasts. Furthermore, we determined that baculoviruses pseudotyped with protein G (VSV) enter the cell more efficiently without the production of higher levels of IFN β. Finally, we studied the involvement of different cytosolic DNA sensors in murine and human cells infected with BV. It was observed that RNA Pol III does not participate in the establishment of the antiviral state. We then studied the cGAS-STING pathway with CRISPR-Cas9 gene editing in murine cells, whereas in human epithelial cells was studied with trans-complementation of cGAS or cGAS and STING in HEK293 and HEK293 T, respectively. The results showed that STING is required for the establishment of an antiviral state in mammalian cells. Moreover, at least two different signaling pathways have an impact on STING and contribute to the baculovirus induced antiviral state. The detection of the viral genome by cGAS sensing induces the strongest cellular response and it is necessary for the production of IFN β. Additionally, the cGAS-independent STING activation produces an antiviral state in human epithelial cells where the production of IFN λ1 is involved. In conclusion, the results of this thesis show that the genome of the baculovirus AcMNPV available in high levels in the cytosol during the infection of nonimmune mammalian cells, has a relevant role in the establishment of an antiviral state and in the production of IFN I and III through its impact in the nucleic acids sensing pathway of cGAS-STING.