Caracterización genética y bioquímica de microorganismos relacionados al metabolismo del litio en aguas y suelos del NOA

Abstract

La obtención de litio ha tomado gran importancia en los últimos años debido a la gran demanda para la producción principalmente de baterías. Este elemento tiene además otras utilidades, como en la industria cerámica y médica. Se conoce que la forma más económica y eficiente de obtener litio es a partir de salmueras naturales con altas concentraciones del metal, distribuidas principalmente en la zona de la puna sudamericana, al oeste de los Estados Unidos y en lagos salinos de China. El Salar del Hombre Muerto, ubicado en el noroeste argentino, es uno de los vértices del ?Triángulo del litio? que incluye toda el área comprendida entre este Salar, el de Uyuni en Bolivia y el de Atacama en Chile. En esta zona se concentra alrededor del 85% del litio soluble a nivel mundial.En la presente tesis doctoral se planteó como objetivo general determinar la influencia del litio sobre diferentes géneros microbianos aislados de muestras ambientales con elevada concentración de mineral y caracterizar la composición de las comunidades microbianas que se encuentran en estos ambientes. A partir de este conocimiento, intentar discernir los mecanismos que les permiten a los organismos tolerar dichas condiciones adversas y sus potenciales capacidades y/o aplicaciones biotecnológicas. Se inició este trabajo determinando la importancia del litio, resaltando sus aplicaciones y demanda a nivel mundial. Posteriormente se describió la distribución del metal alrededor del mundo, teniendo en cuenta las reservas actualmente en explotación como las que aún permanecen sin explotar. Se seleccionó el Salar del Hombre Muerto como sitio de estudio de donde se tomaron muestras de suelo de dos puntos diferentes, de agua dulce y de salmuera. Estas se caracterizaron de acuerdo con su composición química y sus propiedades físicas. También se estudió la composición de la comunidad microbiana en muestras de suelo utilizando técnicas de metagenómica. El análisis de los datos obtenidos permitió establecer una relación entre las propiedades de los suelos con las comunidades microbianas que lo habitan. Por otra parte, se evaluó la presencia de microorganismos mediante microscopía óptica y electrónica en las muestras de agua dulce y salmuera y se aislaron bacterias y hongos mediante técnicas microbiológicas a partir de las muestras disponibles. Del total de 238 cepas bacterianas obtenidas, se continuó el trabajo con aquellas capaces de crecer en altas concentraciones salinas (186), de las que se evaluó su tolerancia al cloruro de litio mediante el crecimiento en medios de cultivo sólido (ensayo del canal) y líquido. Las 36 cepas bacterianas clasificadas como tolerantes en medio líquido (de un total de 56 clasificadas como tal en medio sólido) se caracterizaron en cuanto a su morfología microscópica y la de sus colonias y a su capacidad de formar biofilms y de producir carotenoides. De ellas, 26 cepas se secuenciaron e identificaron empleando técnicas de biología molecular y bioinformática. Se depositaron las secuencias obtenidas en el GeneBank.A partir de los aislamientos bacterianos tolerantes a litio, se seleccionó un grupo de 8 cepas de las que se evaluó la capacidad de crecer en presencia de cloruro de litio y de recuperar el litio soluble. Se verificó que las células poseen la capacidad de remover una fracción del litio soluble y que en algunas de las cepas el litio, en elevadas concentraciones, afectó a la morfología celular.Asimismo, se evaluó la tolerancia al cloruro de litio de 19 cepas de arqueas halófilas, de diferente origen, en medio sólido mediante el ensayo del canal y el crecimiento en medio líquido con diferentes concentraciones de sales de sodio y litio. Se identificaron tres cepas halófilas extremas y dos con capacidad para crecer en altas concentraciones de litio, siendo estas últimas comparables a los aislamientos bacterianos obtenidos.Finalmente, se seleccionó una de las cepas aisladas del Salar del Hombre Muerto, Micrococcus luteus SA211, para profundizar su estudio. Se secuenció y analizó su genoma y metiloma completo, lo que permitió analizar la potencialidad de la cepa y predecir que la mayoría de las proteínas que la cepa podría sintetizar serían ácidas. Se estudió la síntesis diferencial de proteínas de esta (y de otras tres cepas) en ausencia y presencia de sales de litio para identificar las proteínas involucradas en la respuesta al litio, a la vez que se compararon con las sintetizadas en presencia de sodio. Se identificaron 46 proteínas diferencialmente sintetizadas, involucradas en distintas funciones del metabolismo celular, relacionadas con la presencia de litio.En conclusión, se alcanzaron los objetivos propuestos en el tiempo previsto. Este trabajo, primero en su índole con muestras del Salar del Hombre Muerto, constituye una base sólida para profundizar los estudios de las capacidades de las cepas obtenidas y optimizar procesos de recuperación de litio soluble, entre otras potenciales aplicaciones biotecnológicas observadas en las cepas aisladas.

Lithium exploitation has gained great importance in the last years because of the increasing demand mainly for battery production. The element has also other uses, such as in ceramic and medical industry. It is known that the cheapest and most efficient way of obtaining lithium is from natural brines with high concentrations of the metal, which are mainly located in the South American Puna Plateau, in the west of the United States and in salt lakes from China. The Salar del Hombre Muerto, located in the northwest of Argentina, is one of the vertices of the “Lithium Triangle”, which includes all the area between this salt flat, the Uyuni´s in Bolivia and the Atacama´s in Chile. This area harbors around 85% of soluble lithium worldwide. The general objective of this thesis was to establish the influence lithium has on different microorganisms isolated from environmental samples with high mineral concentration and to characterize the microbial communities from these environments. This knowledge would allow to determine the mechanisms used by these organisms to tolerate such adverse conditions and their potential capabilities and/or biotechnological applications. First, the importance of lithium was determined, highlighting its applications and the global demand. Then, the worldwide distribution of the metal was described, considering the reserves currently under exploitation, as well as those that are not yet exploited. The Salar del Hombre Muerto was selected as the study site, from which soil samples from two different points, and fresh water and brine samples were collected. Samples were characterized regarding their chemical and physical properties. Also, the composition of the microbial communities from soil samples was studied using metagenomics. The analysis of the obtained data allowed to establish a relationship between soil properties and the composition of their microbial community. On the other side, the presence of microorganisms was assessed in fresh water and the brine through optic and electronic microscopy. Bacteria and fungi were isolated by microbiological techniques from the all the samples. From a total of 238 bacterial isolates, those able to grow in presence of high salt concentrations (186) were selected and their tolerance to lithium chloride, by culturing them in solid and liquid media, was assessed. The 36 strains classified as tolerant in liquid medium (out of a total of 56 classified as such in solid medium) were further characterized regarding their microscopic morphology and that of their colonies and their capacity for biofilm formation and carotenoid production. From those, 26 isolates were sequenced and identified through molecular techniques and bioinformatics. The sequences were uploaded to the GeneBank database. From the lithium tolerant isolates, a set of 8 strains was selected and their ability to grow in the presence of lithium chloride and to recover soluble lithium was evaluated. The cells´ ability to adsorb a fraction of soluble lithium and the fact that the morphology of some cells was affected due to high concentrations of lithium, were verified. Likewise, the tolerance to lithium chloride of 19 halophile archaeal strains from different origins was assessed in solid media, as well as their ability to grow in liquid media with different concentrations of sodium and lithium salts. Three extreme halophile strains and two able to grow in the presence of high lithium concentrations were identified, being the latest comparable to the bacterial isolates obtained. Finally, Micrococcus luteus SA211, one of the isolates from the Salar del Hombre Muerto, was selected for further studies. Its whole genome and methylome were sequenced and analyzed, allowing to evaluate the strain potential and to predict that most of the proteins that could be produced would be acidic. The differential protein synthesis for this strain (and three others) in absence and presence of lithium, to identify the proteins involved in the response to the metal, were studied, at the time that they were compared to the ones synthesized in the presence of sodium. Forty-six proteins differentially synthesized, involved in different functions of cell metabolism and related to the presence of lithium were identified. To conclude, the aims proposed for this thesis were achieved in the expected time. This work, first of its kind with samples from the Salar del Hombre Muerto, constitutes a solid base to deepen in the study of the isolates capabilities and to optimize the soluble lithium recovery processes, among other potential biotechnological applications observed for the isolated strains.