Análisis de glutatión peroxidasa mediante HPLC-ICP-MS en órganos para trasplante a diferentes intervalos post mortem

Abstract

En mamíferos, se encuentra la enzima glutatión peroxidasa (GPx), una seleno-enzima antioxidante que protege a las células del daño causado por las especies reactivas del oxígeno (ROS) [1]. El estrés oxidativo es el desequilibrio entre las ROS y los sistemas de defensa antioxidantes del organismo, generando alteraciones del ADN, lípidos y proteínas. Este desequilibrio se produce en órganos para trasplante durante la isquemia y la falta de perfusión post mortem, afectando la sobrevida del injerto. Se ha demostrado que un incremento en la actividad de GPx reduce el stress oxidativo post mortem en órganos para trasplante [2]. El objetivo de esta investigación fue analizar las variaciones de concentración de GPx en ratas a diferentes intervalos post mortem (PMI). Además, se estudió la descomposición de seleno-proteínas mediante la evaluación de la presencia de Se en fracciones menores a 10 kDa. Se administró a ratas Wistar con 75 μg/kg/d de selenio-metionina (SeMet) durante 7, 14 y 21 días. Al final de la administración, se sacrificaron las ratas y se recogieron muestras de hígado, corazón y riñón a diferentes intervalos post mortem (PMI). Previa extracción, GPx se determinó mediante cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas (HPLC-ICP-MS). Para los estudios de descomposición, se separaron proteínas de productos de descomposición mediante filtros de centrifugación Amicon™ Ultra con una capacidad de retención molecular (MWCO) de 10 kDa y se analizó selenio en las mismas por ICP-MS.La administración de SeMet produjo un aumento significativo en la concentración de selenio en hígado (65%, p<0,001), corazón (40%, p<0,01) y riñón (45%, p<0,05) respecto al control. A los 7 días de administración de SeMet se evidenció un incremento en la concentración de GPx en todos los extractos de tejidos comparado con el control (p>0.01), la concentración de GPx se encontró en un rango de 0,163±0,01 a 0,750±0,01 mg GPx g-1 de extracto de tejido. Durante el PMI, las enzimas, incluida la GPx, experimentan una disminución en su actividad y estabilidad debido a la degradación y desnaturalización de las proteínas por enzimas hidrolíticas liberadas al citoplasma. La disminución de GPx fue aproximadamente un 20-25%, en comparación con el grupo control, 45-50% (p<0,05). Los órganos administrados con SeMet durante 7 días, mostraron una menor concentración de Se en fracciones (<10 kDa) (p<0.05), la concentración de Se en estas fracciones fue del orden de 0,1 a 0,4 μg Se g-1 de extracto de tejido. Estos resultados establecen que la administración de SeMet incrementa la concentración de GPx en hígado, corazón y riñón de rata. Al mismo tiempo disminuye su descomposición por procesos autolíticos durante el PMI estudiado. Estos resultados orientan hacía la posibilidad de tratar los donantes vivos con SeMet a fin de mejorar la supervivencia de los órganos trasplantados en el receptor.