Elucidando el rol de la proteína rhoGEF KALRN en la infección con Mycobacterium bovis

Abstract

La tuberculosis bovina es una enfermedad zoonótica infecto-contagiosa de gran impacto económico. Mycobacterium bovis, el agente etiológico de la tuberculosis bovina, puede sobrevivir y replicar en macrófagos gracias a su capacidad de modular el tráfico vesicular. M. bovis modifica la activación y reclutamiento de GTPasas de la familia Rab, inhibiendo la maduración del fagosoma que lo contiene y su fusión con los lisosomas. El gen KALRN codifica para una proteína kinasa rhoGEF que regula el tráfico vesicular, y que es necesaria para la replicación del virus HIV en macrófagos humanos. Fue reportado que esta proteína rhoGEF interactúa con Rab11, pero se desconoce la importancia de dicha interacción. Varios polimorfismos en el gen KALRN fueron asociados con un aumento en la susceptibilidad a la infección con M. bovis y M. avium subsp paratuberculosis en bovinos, y a la infección con Brucella spp. en caprinos. Pero todos estos polimorfismos son de baja frecuencia poblacional (≤0,05), y en ningún caso se logró elucidar un rol funcional en la expresión de KALRN y el desarrollo de la infección intracelular. Como paso inicial en el estudio del rol de KALRN en infecciones intracelulares de interés pecuario, nos propusimos realizar un estudio de asociación entre el polimorfismo de Inserción-Deleción rs384223075 (InDel KALRN-75) y la resistencia a la infección con M. bovis en el ganado bovino lechero. Se utilizaron muestras de ADN de 130 vacas lecheras pertenecientes a dos rodeos ubicados en las provincias de Córdoba y Buenos Aires. Se seleccionaron 32 casos y 32 controles de un total de 4.000 bovinos Holstein con una prevalencia de tuberculosis bovina del 15%. Las muestras restantes (32 casos y 34 controles) se seleccionaron de un rodeo de 1.500 bovinos Jersey con una prevalencia del 5%. Los animales fueron clasificados como casos o controles según el resultado positivo o negativo a la prueba de tuberculina ano-caudal (PAC). La región genómica que contiene el InDel KALRN-75 se amplificó por PCR utilizando el método de marcado M13-tailing, y los alelos se resolvieron por electroforesis capilar. Se determinó la asociación genética entre el InDel KALRN-75 y el resultado de PAC utilizando el test exacto de Fisher con el programa VassarStats. El InDel KALRN-75 está ubicado en el intrón 5 del gen KALRN, es de alta frecuencia poblacional y se encuentra en desequilibrio de ligamiento con dos SNPs missense ubicados en el exón 5. Las frecuencias genotípicas mostraron concordancia con el equilibrio de Hardy-Weinberg tanto en el grupo de los controles (p = 0,97) como en el grupo de los casos (p = 0,89). La frecuencia del alelo menor (deleción, “k”) para KALRN-75 fue mayor en los casos (0,27) que en los controles (0,12), y esta diferencia resultó significativa (p = 0,003). Más aún, el genotipo homocigota mayor para KALRN-75 (KK) fue asociado con un resultado negativo para PAC (p = 0,006; Odds Ratio = 3,00; CI = 1,41 – 6,39). Mientras que en los controles la frecuencia del genotipo KK (alelo mayor) fue de 0,77, en los casos fue solo de 0,53. La asociación se mantuvo significativa al analizar cada rodeo por separado (Holstein: p = 0.026; Jersey: p = 0.029). Estos resultados sugieren que la deleción en KALRN-75 (alelo “k”) confiere susceptibilidad frente a la infección con M. bovis. Por un lado, estos resultados preliminares alientan el estudio del InDel KALRN-75 como un marcador molecular para la selección de animales reproductores genéticamente resistentes a la infección con M. bovis. En el presente, estamos ampliando el tamaño muestral de este estudio de asociación, y complementándolo con otro estudio en brucelosis bovina. Por otro lado, este trabajo junto a otros sustentan un rol importarte, aunque poco estudiado, de KALRN en la respuesta inmune a infecciones intracelulares. El polimorfismo KALRN-75 representa una buena herramienta para el estudio del rol de la proteína rhoGEF KALRN en la replicación bacteriana intracelular en macrófagos bovinos.