Efecto de la microcina J25 en la cadena respiratoria de Escherichia coli

Abstract

En la actualidad existe una marcada tendencia a la demanda de alimentos naturales con pocos procesamientos. Además, el uso indiscriminado de antibióticos de amplio espectro ha provocado el aumento de bacterias patógenas multiresistentes a los antibióticos existentes. Las bacteriocinas son consideradas como una posible solución ante esta problemática. En particular, la microcina J25 (MccJ25) es una bacteriocina muy estable activa frente a patógenos transmitidos por alimentos, entre ellos Escherichia coli, Salmonella y Shigella. Posee dos mecanismos de acción, inhibe la transcripción mediante la unión a la ARN polimerasa e inhibe la cadena respiratoria residente en la membrana plasmática.El objetivo de esta tesis fue profundizar el conocimiento del efecto de la MccJ25 sobre la cadena respiratoria de E. coli. A partir de resultados previos, se planteó la hipótesis de que el péptido actúa sobre los citocromos. En la cadena respiratoria de E. coli existen dos tipos de ubiquinol oxidasas, el citocromo bo3 y los citocromos bd (bdI y bdII). Se demostró, in vivo, que estos son fundamentales para la acción inhibitoria de la microcina, siendo las oxidasas más importante los citocromos bo3 y bdI. Empleando cepas de E. coli que tienen aumentada la entrada de la MccJ25 mediante el aumento de expresión de la proteína transportadora FhuA, se observó que las mutantes en los citocromos bo3 y bdI mostraron una marcada disminución de la sensibilidad frente al péptido con respecto a la cepa parental. Además, en ensayos llevados a cabo in vitro el péptido fue capaz de inhibir la actividad ubiquinol oxidasa y de inducir un aumento en la producción de especies reactivas del oxígeno cuando se utilizó el citocromo bdI purificado a partir de la membrana de E. coli. Esta inhibición es dosis dependiente y según las constantes cinéticas (Km y Vmax) sería de tipo no competitiva. Sin embargo, no se observó este mismo efecto cuando el ensayo fue realizado en presencia del citocromo bo3. Por otro lado, el análisis de la diferencia entre los espectros de la forma reducida y oxidada de los citocromos manifestó una reducción directa del citocromo bdI por parte de la MccJ25. Estos resultados indicarían que la MccJ25 podría inhibir de manera directa solo al citocromo bdI. Actualmente, el citocromo bdI es un potencial blanco de acción para antibióticos alternativos ya que solo se encuentra en células procariotas, entre ellas patógenos tales como E. coli, Mycobacterium tuberculosis y Klebsiella pneumonia. Dada la existencia de una relación estructural entre el citocromo bo3 y el complejo IV de la mitocondria se proyectan estudios más profundos para dilucidar el mecanismo de inhibición de la MccJ25 sobre los citocromos. Esto permitiría el desarrollo de estrategias para dirigir específicamente la actividad del péptido al citocromo bdI. De esta manera sería posible diseñar péptidos modificados más eficaces sobre este blanco de acción. La MccJ25 por su naturaleza y porsu capacidad de actuar sobre dos dianas diferentes, una a nivel intracelular y otra a nivel de la cadena respiratoria, es una alternativa prometedora para ser considerada como un nuevo antimicrobiano.

At present there is a pronounced tendency to demand for minimally processed natural foods. Furthermore, misuse of broad-spectrum antibiotics has led to an increase in resistant pathogenic bacteria. Bacteriocins could be considered as a possible solution to this issue. Microcin J25 (MccJ25) is a very stable bacteriocin active against foodborne pathogens, including Escherichia coli, Salmonella and Shigella. This peptide has two targets, one of them is the RNA polymerase through the binding to its secondary channel and the other is the respiration that involves the inhibition of enzymes of respiratory chain. The aim of this thesis was to deepen the knowledge of the effect of MccJ25 on E. coli respiratory chain. From previous results, we hypothesized that the peptide acts on cytochromes. E. coli respiratory chain has two types of ubiquinol terminal oxidases, cytochrome bo3 and cytochromes bd (bdI and bdII). In this work, we demonstrated that these are essential for the peptide inhibitory effect, where cytochromes bo3 and bdI play a fundamental role. The entry of MccJ25 to the target cell was increased by over-expressing the transporter protein FhuA. The cytochromes bo3 and bdI mutants showed a marked decrease sensitivity to the peptide regarding the parental. Additionally, in vitro assays performed using purified cytochrome bdI from E. coli membrane, revealed that the peptide was able to inhibit its ubiquinol oxidase activity and induced an increase in the reactive oxygen species production. This inhibition is dose dependent and it would be a noncompetitive type inhibition according to its kinetic constants (Km and Vmax). However, this effect was not observed when assay was performed with cytochrome bo3. Furthermore, the analyses of reduced minus air-oxidized difference spectra of the purified cytochromes manifested a direct reduction of cytochrome bdI by MccJ25. These findings indicate that MccJ25 could just inhibit cytochrome bdI in a direct way. Cytochrome bdI is found only in prokaryotes, including pathogens such as E. coli, Mycobacterium tuberculosis and Klebsiella pneumonia. Currently, this cytochrome is a potential target for alternative antibiotic. There is a structural relationship between cytochrome bo3 and mitochondrial complex IV. It exist a growing need for deeper studies to elucidate MccJ25 mechanism of cytochromes inhibition. These would allow a development of strategies to specifically lead the peptide activity to the cytochrome bdI. Thereby it would be possible to design modified peptides that are more effective on this target. By its nature and its ability to act on two different cellular targets, one inside the cell and the other at the respiratory chain, MccJ25 is a promising alternative to be considered as a new potential antimicrobials