Síntesis de peptidos bioactivos de interés alimenticio y farmacéutico, utilizando nuevas fitoproteasas

Abstract

Los péptidos bioactivos son secuencias de dos a unas pocas docenas de aminoácidos y con una masa molecular inferior a 6000 Da, y producen diferentes efectos sobre los sistemas del cuerpo humano (cardiovascular, nervioso, digestivo, inmune, etc.). Dichos péptidos son de interés para la industria farmacéutica y alimenticia como agentes terapéuticos, nutracéuticos y conservantes alimentarios. En este trabajo se propone aplicar proteasas pre-purificadas provenientes de los frutos de una planta que crece en Argentina, Bromelia antiacantha Bertol. (Bromelaceae), en forma soluble, suspendida o inmovilizada y en medios acuoso - orgánicos, como catalizador de la síntesis total o parcial de péptidos con potencial actividad antimicrobiana y antihipertensiva, de interés como conservantes alimentarios y nutracéuticos. La originalidad de este trabajo está centrada tanto en la síntesis de péptidos con potencial actividad antimicrobiana y antihipertensiva in vitro utilizando fitoproteasas autóctonas, como en su potencial aplicación a alimentos como conservantes y nutracéuticos. Además, el desarrollo de péptidos híbridos por vía quimo-enzimática, para ampliar el espectro inhibitorio o la efectividad de las secuencias originales, también es un aspecto que aporta novedad científica a la investigación. Se realizaron estudios de ingeniería de medios, de sustratos y del biocatalizador, con el objeto de encontrar las condiciones más promisorias para las reacciones de síntesis enzimática de péptidos con actividad antimicrobiana y antihipertensiva in vitro. Para seleccionar los medios de reacción más promisorios de las síntesis de péptidos, se estudió el efecto de los solventes orgánicos (con diferente grado de hidrofobicidad e hidratación) sobre la actividad proteolítica inicial y la estabilidad operacional de antiacanthaína en sistemas homogéneos, macroheterogéneos y microheterogéneos, utilizando la enzima libre e inmovilizada en glioxil sílica. En los sistemas homogéneos, formados por la mezcla de un solvente miscible y buffer Tris-HCl (0,1 M) pH 8, antiacanthaína expresó entre 3 y 60 % de las actividades proteolíticas en buffer Tris-HCl, obteniéndose los mejores resultados en metanol 30 % (v/v) y buffer Tris-HCl (0,1 M) pH 8. Sólo 70 % (v/v) de acetonitrilo en el mencionado buffer produjo la inactivación de la enzima. En los sistemas macroheterogéneos (líquido – líquido), formados por la mezcla de un solvente inmiscible y buffer Tris-HCl (0,1 M) pH 8, los mejores resultados se 20 obtuvieron con acetato de etilo y hexano 50% (v/v). En estos medios, antiacanthaína expresó 108 y 119 % de las actividades proteolíticas en buffer Tris-HCl, respectivamente. No obstante, la mayoría de los medios bifásico estudiados fueron activantes y estabilizantes para la enzima. Por el contrario, en los sistemas microheterogéneos (solventes orgánicos con bajo contenido acuoso, Xw en la enzima: 1 x 10-5 ) antiacanthaína expresó muy bajas actividades proteolíticas, respecto de la obtenida en buffer Tris-HCl (0,1M) pH 8. El efecto de los de los solventes orgánicos sobre la estructura secundaria de antiacanthaína A se estudió por FTIR, y se evaluó mediante el coeficiente de similitud espectral (r), tomando como referencia la estructura secundaria obtenida en buffer TrisHCl (0,1 M) pH 8. Los resultados obtenidos indicaron que antiacanthaina A en los sistemas acuosos – orgánicos estudiados tuvo baja similitud espectral respecto de buffer. Sin embargo, algunas de dichas estructuras le impidieron expresar su actividad proteolítica mientras otras produjeron activación, tal es el caso de acetato de etilo y hexano (50% (v/v)). En consecuencia, los cambios en la expresión catalítica de antiacanthaína en los medios acuoso – orgánicos estudiados no están vinculados con la estructura secundaria que la enzima adquiere en ellos. Para la selección del donador de acilo para las reacciones de síntesis, se realizaron estudios de preferencias de antiacanthaína por diversos derivados aminoácidos sintéticos, en los medios de reacción previamente descriptos. Antiacanthaína en buffer Tris-HCl (0,1 M) pH 8 exhibió amplia preferencia por los derivados aminoacídicos no polares (excepto Val); mientras que las preferencias de antiacanthaína en los sistemas acuoso – orgánicos estudiados variaron en cada uno de ellos, y también respecto de buffer. De manera similar que en solución acuosa, antiacanthaína en metanol 30 % (v/v) mantuvo sus preferencias por los aminoácidos no polares, mientras que en acetato de etilo o hexano 50 % (v/v) antiacanthaína mostró preferencia por los aminoácidos polares. En consecuencia, en base a la estabilidad operacional de antiacanthaína se seleccionaron como sistemas de reacción más promisorios para las síntesis de péptidos bioactivos de interés, metanol 30% (v/v), acetato de etilo 50% (v/v) y hexano 50% (v/v); a 40 ºC, pH 9 (en la fase acuosa) y 200 rpm. Además, en base a las preferencias de antiacanthaína en dichos medios de reacción, se seleccionó N--CBZ-Tyr-pNO como donador de acilo y Val-OH, Leu-OH o Gln-OH como nucleófilos. 21 A partir de la base de datos BIOPEP (2012) y tomando como base las preferencias de antiacanthaína, se seleccionaron los péptidos: Tyr-Leu-OH (YL) y Tyr-Val-Leu-OH (YVL), con actividad antihipertensiva y antimicrobiana in vitro, respectivamente; con el objeto de sintetizar por vía química y enzimática los análogos, o sus precursores. Además, y con el mismo objetivo, se seleccionaron otros péptidos obtenidos de novo en el Laboratorio de Bromatología (UNSL), a partir de hidrolizados de derivados casearios (Bersi y col., 2018). Resultó de particular interés el tripéptido Tyr-Gln-Gln (YQQ), puesto que dicha secuencia no se encuentra reportada en las bases de datos de péptidos bioactivos, tales como: PepBank, PeptideDB, BIOPEP; ni en las bases de datos de péptidos antimicrobianos APD2, Antimicrobial Peptide Database. Se obtuvieron con éxito los péptidos N-α-CBZ-Tyr-Leu-OH (Z-YL, análogo de YL) y N-α-CBZ-Tyr-Val-OH (Z-YV, análogo del precursor (YV) de YVL) por síntesis enzimática bajo control cinético en acetato de etilo 50% (v/v), utilizando anticanthaína en forma libre como catalizador, con rendimientos en producto de 63 % y 52 % respectivamente. El grado de conversión de sustrato limitante en producto fue de 75 % y 100 %, respectivamente. Este hecho fue debido a la reacción competitiva de hidrólisis del sustrato, danto el producto de hidrólisis N-α-CBZ- Tyr-OH. En cambio, en metanol 30% (v/v) la reacción de síntesis enzimática bajo control cinético dio lugar a la formación de los tetrapéptidos N-α-CBZ-Tyr-(Leu)2-Leu-OH y N-α-CBZ-Tyr-(Val)2-Val-OH, en lugar de los dipéptidos esperados; los cuales fueron dilucidados por espectroscopía de masas y poseen m/z: 654,85 y m/z: 612,58, respectivamente. Además, la síntesis enzimática de Z-YL y Z-YV bajo control termodinámico no procedió exitosamente, tanto en acetato de etilo 50% (v/v) como en metanol 30% (v/v), indicando que la presencia de un donador de acilo activado es fundamental para que la síntesis de ambos péptidos pueda ser catalizada por antiacanthaína. La síntesis enzimática de N-α-CBZ-Tyr-Gln-OH (Z-YQ, análogo del precursor (YQ) de YQQ) en sistemas homogéneo y macroheterogéneo no procedió. Probablemente, la alta preferencia de antiacanthaina por Gln en el medio bifásico (90%), en relación al derivado Tyr (70%), haya impedido el uso de éste último como donador de acilo por parte de la enzima. Estos resultados validan la estrategia aplicada para la selección de los sustratos en este trabajo. 22 Finalmente, se logró la síntesis quimo-enzimática del tripéptido híbrido N-- CBZ-Tyr-Leu-Leu (Z-YLL, derivado de beta lactorfina (Tyr-Leu-Leu-Phe) proveniente de α-lactoalbúmina y β-lactoglobulina, en dos etapas que incluyeron la SPPS de LeuLeu, y la unión de éste a N--CBZ-Tyr-pNO por síntesis enzimática, utilizando acetato de etilo (50%(v/v)) y buffer Tris-HCl 0,1M (pH 9) como medio de reacción. La identidad y el peso del molecular del tripéptido Z-YLL fueron dilucidados por ESI-MS. La actividad antihipertensiva de Z-YL (análogo de YL, sintetizado por vía enzimática), YQQ (péptido de novo, sintetizado por SPPS) y Z-YLL (péptido híbrido, sintetizado por vía quimo-enzimática); se evaluó como actividad inhibitoria de la ECA en ensayos in vitro. Sorprendentemente el péptido híbrido (Z-YLL), sintetizado por vía quimo-enzimática en nuestro laboratorio, presentó un porcentaje de inhibición notablemente superior (93%) a Z-YL (53%) y también mayor que YL (84%). Además, el péptido YQQ sintetizado (de novo) en nuestro laboratorio por SPPS presentó un porcentaje de inhibición de la ECA de 85%. Este valor es similar al informado por Mullally y col. (1996) para el péptido YL (84%). La actividad antimicrobiana de YVL (sintetizado por SPPS); YV (precursor de YVL, sintetizado por SPPS) y Z-YV (análogo del precursor YV, sintetizado por vía enzimática); se evaluó en un cultivo de bach a escala de laboratorio, frente a una cepa grampositiva (Staphylococcus aureus ATCC 25923) y frente a una cepa gramnegativa (Escherichia coli ATCC 25922). Las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) de YVL, YV y Z-YV frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 fueron 57µg/ml, 49µg/ml y 50µg/ml, respectivamente. Estos resultados fueron 83, 57 y 61% mayores que la CIM de oxacilina (31,1µg/ml). En consecuencia los péptidos YVL, YV y Z-YV presentaron un efecto bacteriostático contra S. aureus. Las CIM de YVL, YV y Z-YV frente a Escherichia coli ATCC 25922 fueron 32µg/ml, 57µg/ml y 54µg/ml, respectivamente. Estos resultados fueron 1,5; 2,6 y 2,5 veces mayores que la CIM de ácido nalidíxico (21,7µg/ml). En consecuencia, los péptidos YVL, YV y Z-YV, presentaron un efecto bacteriostático contra E. coli. Por otra parte, la actividad anticoagulante del péptido YQQ se determinó mediante Wiener Lab Test. El péptido YQQ (sintetizado químicamente), actuó en la vía intrínseca de la cascada de coagulación, específicamente sobre algunos factores de la 23 misma (VIII, IX, XI y XII) incrementando 105% el tiempo de coagulación con respecto al control. Mediante la determinación cuantitativa de fibrinógeno en plasma humano por el método inmunoturbidimétrico, se demostró que YQQ solo causó el 4% de la inhibición de trombina, indicando que YQQ actúa en la vía intrínseca de la cascada de la coagulación en algún punto anterior del factor X. Este factor produce el factor Xa (activado) que permite la conversión de protrombina (II) en trombina (IIa), y ésta cataliza la conversión de fibrinógeno a fibrina y la formación del coágulo. El valor de Tiempo Parcial de Tromboplastina Activado (APTT) observado para YQQ es 2 veces el valor del control (siendo el rango terapéutico aceptado 1,5 a 2,5 veces el valor del control de APTT) y 32% más alto que el valor de APTT para Heparina. Dicho resultados pusieron de manifiesto su potencial no solo como agente antihipertensivo sino también como anticoagulante. Además, se demostró que el péptido YQQ retuvo la actividad anticoagulante en un pool de plasma humano de individuos sanos, demostrando la alta estabilidad del péptido sintetizado en el rango de tiempo estudiado. La toxicidad aguda del péptido YQQ se determinó como porcentaje de viabilidad celular después de la exposición de la línea celular humana 293 FT a diferentes concentraciones del péptido YQQ, durante 4 horas a 37 °C en atmósfera de 5% de aire enriquecido en CO2. El péptido YQQ no fue citotóxico en ensayos in vitro a las concentraciones estudiadas, ya que no produjo disminución significativa (p ≤ 0,05) en la supervivencia celular en tales condiciones, según la prueba de Kruskall-Wallis. Bajo algunas condiciones de tratamiento, se midieron las tasas de supervivencia por encima del control (100%). Sin embargo, como estas diferencias son inferiores al 10%, no se consideran un efecto proliferativo significativo y parecen estar relacionadas con el fenómeno de hórmesis, que se caracteriza por producir estimulación o efecto beneficioso a bajas dosis y efecto inhibidor o tóxico a altas dosis. En general, este trabajo aporta nuevas estrategias y productos de interés para la industria alimenticia que implican una expansión del mercado actual en materia de nutracéticos y conservantes alimentarios seguros, y la potencial transferencia de resultados al sector socio-productivo interesado en los mismos.