Caracterización de la cepa mutante rcsC11 de Salmonella Typhimurium para su implementación como vacuna atenuada

Abstract

Las enfermedades gastrointestinales producidas por Salmonella enterica (S. enterica) constituyen un grave problema de salud a nivel mundial. Si bien la mayoría de estas enfermedades son pasajeras, en personas más vulnerables pueden causar cuadros más severos, incluso su muerte. Por ello resulta importante la aplicación de estrategias que prevengan y controlen estas enfermedades. Actualmente, se emplean vacunas desarrolladas con microorganismos atenuados en virulencia. La mutante rcsC11 de S. Typhimurium (objeto de este estudio) presenta características fenotípicas que resultan en la atenuación de la virulencia. Además, se ha demostrado que en ratones dicha cepa atenuada no sólo es incapaz de desarrollar la enfermedad, sino que además otorga al ratón protección frente a una posterior infección con la cepa virulenta. El objetivo del presente trabajo fue realizar un estudio profundo de las características de la mutante rcsC11 que conducen a la atenuación de su virulencia, para el desarrollo de vacunas atenuadas activas contra diferentes serovares de Salmonella.Se determinó la estabilidad del alelo mutado rcsC11 cuando la cepa es expuesta a condiciones de estrés similares a las que enfrenta dentro del hospedador. De todas las condiciones ensayadas, sólo la acidez del medio y la ausencia de oxígeno mostraron afectar a la estabilidad de la mutante. Sin embargo, por secuenciación del gen rcsC se confirmó que la mutación puntual se mantiene estable en todas las posibles revertantes. Aun así, se caracterizaron las colonias atípicas y en todos los estudios mostraron un perfil distinto a la cepa rcsC11 parental, pero similares al de la cepa salvaje. Se comprobó que cepas salvajes de S. Typhimurium también presentan colonias distintas bajo las mismas condiciones de estrés probadas, y sus características fenotípicas también muestran diferencias respecto a la cepa salvaje original. Por ello, se concluyó que los cambios detectados en las colonias rcsC11 atípicas están relacionados a un comportamiento propio de cepas de S. Typhimurium ante situaciones de estrés.Se analizó además la capacidad de infección de las cepas rcsC11 y salvaje en células eucariotas con el fin de determinar cambios en los factores involucrados en la respuesta inmune innata producida por cada una. Se utilizaron modelos de infección con células epiteliales intestinales, como la primera barrera que enfrenta el enteropatógeno; y con macrófagos, como células importantes en la respuesta inmune. Se demostró que rcsC11 es capaz de invadir dichas células epiteliales y de ser fagocitada por macrófagos, pero en menor proporción que la cepa salvaje. La mutante mostró deficiencias en la capacidad de replicación dentro de estas células, siendo difícilmente detectable en el último tiempo. Esto indica que, a pesar de su fenotipo atenuado y su replicación deficiente, rcsC11 es percibida por las células hospedadoras donde induce una respuesta inmune innata similar a la de la cepa salvaje durante las primeras horas de infección, siendo posteriormente eliminada para no producir la enfermedad.Los resultados obtenidos contribuyen al entendimiento del mecanismo de atenuación de la cepa rcsC11 y sostienen el estudio de su posible aplicación en el desarrollo de vacunas atenuadas activas contra Salmonella.

Gastrointestinal diseases caused by Salmonella enterica (S. enterica) are, currently, a serious health problem worldwide. Even though most of these diseases are transient, in more vulnerable people they can cause more severe illnesses, even death. This is the reason why it is important to apply strategies that help to prevent and get control of these diseases. Currently, a number of gastrointestinal diseases produced by bacteria as etiological agents are controlled by vaccines developed with microorganisms which display an attenuated virulence phenotype and can control the infection of pathogenic strains belonging to the same species. The rcsC11 mutant strain of S. Typhimurium (object of this study) present phenotypic characteristics that result in the attenuation of virulence. Besides it has been demonstrated that it is incapable of developing the disease in mice, and also that it gives the mouse some type of protection against a subsequent infection with wild type strain. The objective of the present work was the study of the rcsC11 mutant strain of S. Typhimurium for the development of active attenuated vaccines. First, the stability of the point mutation in rcsC gene present in rcsC11 strain was determined by exposing it to stress conditions that could be faced within a host organism. Only the acid medium and the absence of oxygen were shown to affect the mutant stability. However, by sequenced rcsC gene confirmed that point mutation remains stable in all isolates. Even so, atypical colonies of rcsC11 were characterized, and in all studies, they showed a different profile to parental rcsC11 strain and similar to the wild type strain profile. However, it was found that wild type strains of S. Typhimurium also present different colonies by growing under the same stress conditions tested. Also, same phenotypic characteristics of atypical wild type strain differ to the original strain. Therefore, differences in atypical colonies phenotype is possibly related to a characteristic behavior of S. Typhimurium under stress conditions. On the other hand, in vitro infectivity capacity of the mutant and wild type strain to eukaryotic cells and the innate immune response produced was analyzed. For this purpose, infection models were used with intestinal epithelial cells, as the first barrier to the enteropathogen, and with macrophages, as important cells in the immune response. It was demonstrated that rcsC11 is capable of invading the epithelial cell and of being phagocytosed by macrophages, although in a lower proportion than the wild type strain. In addition, the mutant shows strong deficiency in replication capacity within these cells, and is hardly detectable in the last infection times. However, despite its attenuated phenotype and poor replication, the rcsC11 strain is perceived by the host cells and is capable to produce an innate immune response similar to wild type strain during the first hours of infection, being subsequently eliminated so as not able to produce the disease. These studies contribute positively to understanding the attenuation mechanisms of rcsC11 and support their study as a candidate for the development of an active attenuated vaccine.