Sistemas mono-enzimáticos de desglicosilación de flavonoides (diglicosidasas) para su aplicación en procesos tecnológicos

Abstract

Los flavonoides son metabolitos secundarios vegetales y, como tales, son ubicuos en los ecosistemas. En general, se encuentran glicosilados y en su reciclo natural, la desglicosilación es el primer paso catabólico seguido de la oxidación de la estructura aromática. Las diglicosidasas son enzimas que catalizan la hidrólisis del enlace heterosídico y liberan el disacárido y su correspondiente aglicona en una única reacción. El hongo Acremonium sp. DSM 24697 ha sido descripto como productor de una diglicosidasa, denominada 6-O-α-ramnosil-β-glucosidasa I, específica para flavonoides 7-O-rutinosilados. Si bien la hidrólisis del flavonoide 3-O-rutinosilado rutina no ha sido detectada con esta enzima, esta cepa es capaz de crecer con rutina como fuente de carbono. Basados en estos resultados previos, en el presente trabajo se estudió el sistema enzimático de Acremonium sp. DSM 24697 para la desglicosilación de rutina. Además se realizó una exploración de nuevas diglicosidasas en 28 cepas de los géneros Acremonium y Sarocladium utilizando diversos flavonoides (rutina, diosmina y hesperidina) como fuente de carbono. Rutina (quercetin-3-O-(6-O-α-L-ramnopiranosil-β-D-glucopiranósido) es un flavonoide compuesto por el polifenol quercetina y el disacárido rutinosa. Su desglicosilación enzimática es usualmente cuantificada mediante HPLC debido a la carencia de un método de screening rápido. Así, el desarrollo y validación de un método espectrofotométrico para la cuantificación de quercetina permitió medir la actividad desglicosilante de rutina y evaluar un número mayor de muestras en el tiempo. Los valores máximos de actividad enzimática para Acremonium sp. DSM 24697 y Sarocladium strictum DMic 093557 fueron 11.04 ± 1.15 U/L y 22.4 ± 4.1 U/L, respectivamente. En ambos casos, los productos de reacción se identificaron como rutinosa y quercetina, confirmando la producción de la actividad diglicosidasa.La diglicosidasa de Acremonium sp. DSM 24697 que hidroliza el flavonoide rutina, fue denominada 6-O-α-ramnosil-β-glucosidasa II. Esta última posee un peso molecular aparente de 85 kDa, un pH y una temperatura óptima 5.0 y 50 °C respectivamente. Este catalizador mostró una alta promiscuidad de sustratos respecto de las diglicosidasas descriptas en literatura. Fue capaz de hidrolizar 3-O-rutinósidos, 7-O-rutinósidos y con menor especificidad también hidrolizó 7-O-neohesperidósidos y los polisacáridos xilano y laminarina. El gen que codifica esta proteína se identificó en la secuencia del genoma de Acremonium sp. DSM 24697 y se expresó funcionalmente en Pichia pastoris. La proteína se clasificó dentro de las glicósido hidrolasas de la familia 3 (GH3) a diferencia de las diglicosidasas fúngicas conocidas, que pertenecen a las familias GH1 y GH5. Dentro de esta familia, αRβG II es el primer catalizador que actúa en modo endo y, de acuerdo al mecanismo de reacción retaining de la familia GH3, es capaz de transglicosilar. De esta forma, se sintetizaron rutinósidos de alcoholes primarios, secundarios y fenólicos.Un trabajo de ingeniería del medio de reacción fue llevado a cabo para incrementar la eficiencia de la desglicosilación de flavonoides. Para ello, la catálisis con las diglicosidasas de Acremonium sp. DSM 24697 se realizó en presencia de solventes altamente eutécticos (DES). Los mismos están compuestos por una base de nitrógeno cuaternario y un dador de hidrógeno. La enzima 6-O-α-ramnosil-β-glucosidasa I desglicosiló hesperidina en DESs compuestos por colina- glicerol y colina-etilenglicol en proporciones de hasta 40% v/v DES-Buffer. La actividad de desglicosilación aumentó significativamente cuando la reacción se realizó en un medio que contenía los componentes individuales de los DES (glicerol y etilenglicol) (40% v/v de glicerol produjo un incremento del 140% de la actividad enzimática).

Flavonoids are secondary plant metabolites and, as such, are ubiquitous in ecosystems. In the natural recycling of flavonoids, deglycosylation is the first catabolic step followed by the oxidation of the aromatic structure. Deglycosylation in a single reaction is catalyzed by diglycosidases, enzymes that release the aglycone and the entire disaccharide. The fungus Acremonium sp. DSM 24697 has been described as a producer of a diglycosidase, α-rhamnosylβ-glucosidase I, specific for 7-O-rutinosylated flavonoids. While it did not display activity against the flavonoid 3-O-rutinosylated rutin, this strain is able to grow with rutin as a carbon source. Based on these previous results, in this work we studied the enzymatic system of Acremonium sp. DSM 24697 for rutin deglycosylation. In addition, an exploration of new diglicosidases was performed. Several flavonoids (rutin, diosmin and hesperidin) were used as a carbon source to cultivate 28 strains (genera Acremonium and Sarocladium). Rutin (quercetin-3-O- (6-O-α-L-rhamnopyranosyl-β-D-glucopyranoside)) is a flavonoid composed of the polyphenol quercetin and the disaccharide rutinose. Herein, a simple spectrophotometric method for the quantification of quercetin was developed and validated for the quantification of rutin deglycosylating activity. The maximum values of enzymatic activity were 11.04 ± 1.15 U/L and 22.4 ± 4.1 U/L for Acremonium sp DSM 24697 and S. strictum DMic 093557 respectively. The reaction products were identified as rutin and quercetin, confirming the production of the diglycosidases. The diglycosidase of Acremonium sp. DSM 24697 that hydrolyzes rutin was called α-rhamnosylβ-glucosidase II (αRβG II). This enzyme has an apparent molecular weight of 85 kDa (optimum pH 5.0, optimum temperature 50°C). αRβG II showed higher substrates promiscuity in comparison to the diglycosidases reported. It was able to hydrolyze 3-O-rutinosides, 7-Orutinosides and, with lower activity, it also hydrolyzed 7-O-neohesperidosides, xylan and laminarin. The gene of αRβG II was identified in the genome of Acremonium sp. DSM 24697 and functionally expressed in Pichia pastoris. αRβG II was classified into glycoside hydrolases family 3 (GH3) unlike known fungal diglicosidases, which belong to GH1 and GH5. It is the first GH3 endo-acting enzyme and, in agreement with the retaining mechanism of family GH3, α-Lrhamnosyl-β-D-glucosidase II was able to transglycosylated primary, secondary and phenolic alcohols. A medium engineering was carried out to increase the efficiency of deglycosylation of flavonoids. The catalysis with both diglycosidases of Acremonium sp. DSM 24697 was performed using deep eutectic solvents (DESs) as co-solvents. DES result from the complexation of quaternary ammonium salts (hydrogen acceptor: HA, e.g. choline chloride) with hydrogen bond donors such as amines, amides, alcohols or carboxylic acids. αRβG I deglycosylated hesperidin choline-glycerol and choline-ethylene glycol DESs composed with 40% v/v DES-Buffer. The enzymatic deglycosylation of hesperidin by αRβG I was observed when DES composed of choline chloride and glycerol or ethylene-glycol was used at proportions of up to 40% (DES-Buffer, v/v), displaying a promising framework to combine enhanced flavonoid solubilities and high enzymatic activities. Whereas deleterious effects were observed when choline chloride was solely added, presumably due to its chaotropic effect. The deglycosylation activity significantly increased when the single DES components – glycerol and ethylene-glycol – were added (e.g. 140% of enzyme activity at glycerol at 40% v/v).