Evaluación de aislado proteico de amaranto como fuente de péptidos antioxidantes: estudios in vitro e in vivo

Abstract

El estrés oxidativo se ha relacionado con una gran variedad de enfermedades crónicas no transmisibles y muchos de los procesos así como los cambios generados a nivel celular se pueden utilizar como biomarcadores del mismo. Por otro lado, se ha demostrado la presencia en la semilla de amaranto de péptidos bioactivos con capacidad antioxidante principalmente mediante ensayos in vitro. El objetivo de este trabajo fue profundizar el estudio de aislado proteico de amanto como fuente de péptidos antioxidantes mediante estudios ex vivo, in vitro celulares e in vivo. Para la obtención de los péptidos antioxidantes se utilizó un método estático simplificado de simulación de la digestión gastrointestinal sobre el aislado proteico de amaranto que fue comparado con un método internacionalmente consensuado cuyo procedimiento presento algunas diferencias con respecto al método simplificado: presencia de una fase oral además de la gástrica y la intestinal, composición más completa de fluidos simulados, diferentes valores de pH así como de concentración de enzimas y de tiempo de contacto enzima/proteína. Los aislados digeridos por ambos métodos presentaron características similares en cuanto al grado de hidrolisis (TNBS), el contenido de proteína total y soluble (microKjeldahl y lowry), el perfil electroforético (SDS-PAGE y Tricina SDS-PAGE) y las actividades antioxidantes evaluadas por el método de ORAC y HORAC. Los aislados digeridos también se evaluaron mediante cromatografía de exclusión molecular, obteniéndose perfiles similares, y se separaron las fracciones correspondientes según su masa molecular. Las fracciones de los distintos digeridos también presentaron similar comportamiento al evaluar su actividad antioxidante (ORAC y HORAC). De esta forma se pudo reafirmar la utilización del método simplificado en la obtención del aislado digerido y de sus fracciones en los ensayos posteriores. Además, se caracterizaron 10 péptidos sintéticos derivados del aislado digerido a partir de su actividad antioxidante (ORAC y HORAC) y a partir de ensayos in sílico a fin de incorporar información sobre características fisicoquímicas y de interacción con al célula. Se evaluó el efecto antioxidante del aislado digerido, de sus fracciones y de los péptidos sintéticos por distintas metodologías.Todas las muestras presentaron un efecto en la prevención de la oxidación de las LDL (proceso que tiene importancia en el desarrollo de la enfermedad cardiovascular) evaluada mediante: tiempo de inducción y velocidad de propagación de la formación de dienos conjugado (DC) y de compuestos fluorescentes (CF), presencia de sustancias reactivas al TBA (TBARS) y movilidad electroforética de LDL. Las fracciones más activas fueron las correspondientes a masas moleculares entre 0,52-1,4 kDa (F23-F29) y los péptidos sintéticos P3, P7 y P10 (carga negativa e hidfrofílico, carga positiva e hidrofóbico y carga positiva e hidrofílico respectivamente). Se encontró una falta de correlación entre los valores de actividad antioxidante por los métodos in vitro en solución de estos tres péptidos (ORAC y HORAC) con los resultados obtenidos en la prevención de la oxidación de las LDL probablemente debida a que la molécula de LDL es más compleja y está en dispersión por lo que pueden entrar en juego otros factores como concentración, interacciones y cambios conformacionales. Se determinó la actividad antioxidante intracelular mediante cultivos celulares de Caco-2 TC7 que fueron incubados en primer lugar con las muestras y luego sometidos a inducción de la oxidación con H2O2 o AAPH. Posteriormente se evaluó el efecto de las muestras sobre la inhibición de la formación de ROS intracelulares (mediante el uso de la sonda diacetato de 2´7´-diclorodihidrofluoresceína) y sobre la actividad de las enzimas antioxidantes: superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPx) y sobre el contenido de glutatión reducido (GSH), antioxidante endógeno celular no enzimático. También se evaluó el efecto sobre la oxidación de lípidos celulares mediante el ensayo de TBA y sobre el daño a nivel mitocondrial y de membrana plásmatica por doble marcación con ioduro de propidio y rodamina 123 y citometría de flujo. Todas las muestras, evaluadas, con excepción de P8 y P9 presentaron una disminución parcial o al estado basal de oxidación celular del contenido de ROS mientras que se encontraron varios comportamientos en cuanto a las actividades enzimáticas y el contenido de GSH (aumento, disminución o sin efecto). Se encontró menor efecto en el contenido de TBARS y ningún efecto en la prevención del daño mitocondrial y de membrana plásmatica. Al evaluar los controles de oxidación máxima por inducción y de oxidación basal para todos los ensayos, en líneas generales no se encontró un estado de oxidación importante que pueda haber sido dañino. P8 presentó valores altos de inhibición de ROS por métodos in vitro acelulares (ORAC y HORAC) mientras que no presentó efecto en la inhibición de ROS intracelular. Paralelamente, ocurrió lo contrario para P6 y P10. Esta falta de correlación entre ensayos acelulares y celulares puede deberse a que los péptidos en cuestión sufren modificaciones en presencia de las células que cambian la actividad o que ejercen su acción por mecanismos distintos a la neutralización directa de las ROS. Por otro lado se evaluó la absorción de las muestras al ser puestas en contacto con monocapas de células Caco-2 TC7 en insertos de policarbonato que simulan la pared intestinal y las posibles modificaciones que pueden ocurrir durante el proceso debido a las peptidasas del borde en cepillo. Se encontró en algunos casos modificaciones diversas y pasaje a través de la monocapa de productos así como absorción de componentes originales (sin modificar). Varias muestras presentaron algún grado de resistencia a la modificación por peptidasas y dado que varias presentaron buenos valores de inhibición de ROS podrían ejercer su efecto en las celulares intestinales previniendo patologías asociadas a esta. P3 y F28 que habían presentado efectos en la prevención de la oxidación de las LDL resistieron (parcial o totalmente) la degradación por peptidasas por lo que podrían atravesar la pared intestinal y ejercer su efecto sobre estas partículas. Por último se evaluó el efecto de la incorporación de aislado proteico de amaranto en las dietas de ratas wistar. Se utilizó como controles una dieta básica recomendada para el mantenimiento de estos animales (C), una dieta con el agregado de colesterol y grasa porcina (COL+G), con el objetivo de inducir el estrés oxidativo en los animales y una dieta con el agregado de colesterol, grasa y vitamina E como antioxidante conocido (COL+E+G). La administración del amaranto se hizo junto al agregado de colesterol y grasa, en forma crónica y aguda; en la primera dieta se administró el aislado en menor concentración durante más tiempo, COL+G+A1 (reemplazo del 25 % de caseína, durante 4 semanas) y en el segundo caso se realizó en mayor concentración durante menos tiempo COL+G+A2 (3 semanas de COL+G y 1 semana de la dieta con reemplazo del 50 % de caseína). Después del sacrificio se recolectó el plasma, el colon y el hígado y se evaluaron diferentes parámetros del estrés oxidativo. Al evaluar los resultados obtenidos para los controles no se logró evidenciar un estado de estrés oxidativo en los parámetros evaluados lo cual podría deberse al tipo de grasa utilizada o al tiempo de administración de las dietas. A pesar de esto se pudieron encontrar algunos efectos como resultado de la incorporación de aislado de amaranto en las dietas siendo la administración aguda la que presentó mayor efecto: para la administración crónica se encontró un mayor aumento de la capacidad reductora del plasma y menor contenido de GSH en hígado, mientras que para la dieta aguda, se encontró además de estos mismos efectos, menor contenido de GSH en colon y menor actividad de GPx en hígado. Estos resultados demostraron que durante la digestión del aislado se liberaron productos que lograron absorberse y lograr los efectos mencionados. A partir de los resultados obtenidos en este trabajo se reafirmó que el aislado proteico de amaranto es fuente de péptidos bioactivos antioxidantes y que puede ejercer su efecto biológico a distintos niveles y a partir de diferentes mecanismos. Se plantea como objetivo poder desarrollar una formulación que contenga al aislado de amaranto como ingrediente y evaluar efectos de la matriz y procesamientos sobre la biodisponibilidad y bioactividad de los péptidos así como el posible desarrollo de matrices o vehículos conteniendo alguno/s de los péptidos para lograr una acción en un sitio específico.