Desarrollo de complementos dietarios funcionales usando probióticos lácticos deshidratados como estrategia de innovación

Abstract

El desarrollo de probióticos lácticos deshidratados implica un desafío científico-tecnológico y reviste gran interés como herramienta de innovación para ampliar el mercado de alimentos y/o suplementos dietarios con propiedades funcionales. El proceso de secado por pulverización genera estrés térmico, osmótico y oxidativo para las células, con pérdida de viabilidad y/o de su actividad metabólica. El inmunobiótico Lactobacillus (L.) rhamnosus CRL1505 es objeto de continuo estudio por sus propiedades beneficiosas en salud. El objetivo de este trabajo de tesis doctoral fue conocer su comportamiento frente a situaciones de estrés derivadas del proceso de deshidratación y sentar las bases tecnológicas para el desarrollo de complementos dietarios probióticos. Se formuló un medio de cultivo económico (MCM) de base no láctea para la producción de biomasa, que contiene una elevada concentración de sales de fosfato (9,2 g/L). En este medio se evidenció la presencia de gránulos de polifosfato (polyP) en el citoplasma del inmunobiótico CRL1505, mediante la estandarización de diferentes técnicas (microscopía óptica y electrónica de transmisión, fluorescencia, RT-PCR, PAGE, espectrofotometría). Se relacionó la acumulación intracelular de polyP y la concentración de fosfato del medio de cultivo, estableciéndose dos condiciones para obtener células con alto y bajo contenido de polyP: MCM y MCM(-), respectivamente, según la concentración de fosfato del medio de cultivo. Posteriormente, se evaluó la tolerancia intrínseca de los cultivos a estrés térmico, oxidativo y osmótico, confirmándose que dicha tolerancia requiere 9,2g/L de sales de fosfato inorgánico para obtener la tolerancia a estrés observada. Se evaluó el efecto de pH y la fase de crecimiento sobre la acumulación de polyP y tolerancia a shock térmico usando bioreactores (1,5 L). Se estableció la condición óptima de cultivo para obtener células tolerantes a estrés: crecimiento a pH libre y cosecha en fase estacionaria. La respuesta a estrés del inmunobiótico CRL1505 se evaluó en diferentes medios de shock térmico, obteniéndose los mejores resultados con un pool de sales inorgánicas (MCM3) conteniendo Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4 y MnSO4. Establecidas las condiciones óptimas de producción de biomasa con máxima tolerancia a estrés, se procedió al secado por pulverización (escala laboratorio) en dos matrices: maltodextrina (polvo A) y maltodextrina-MCM3 (polvo B). La sobrevida celular fue mayor en el polvo B (72,5 %) respecto al A (42,8 %), poniéndose en evidencia el efecto termoprotector de MCM3. Finalmente, se evaluó el efecto biológico de extractos intracelulares de L. rhamnosus CRL1505 conteniendo polyP y de un polyP sintético (control) mediante ensayos in vivo utilizando un modelo murino de inflamación pulmonar aguda. Se demostró que los polyP evitan el desarrollo de una respuesta inflamatoria local en las vías respiratorias.En esta Tesis Doctoral se establecieron diferentes estrategias para mejorar la sobrevida del probiótico CRL1505 a estrés relacionado con el proceso de secado: medio de cultivo de bajo costo con alto contenido de fosfato inorgánico; aumento de polyP intracelular; agregado de MCM3 (pool de sales inorgánicas) a la matriz de secado. El uso de polyP de L. rhamnosus CRL1505 como un nuevo biocompuesto con propiedades funcionales es una de las proyecciones de este trabajo.

The dehydration of lactic acid probiotics implies a scientific-technological challenge, and it is of great interest to expand the market of food and dietary supplements with functional properties. The spray drying process generates thermal, osmotic and oxidative stress for the cells with loss of viability and/or metabolic activity. The immunobiotic Lactobacillus (L.) rhamnosus CRL1505, used in this study, is under continuous study because of its beneficial health properties. The objective of this phD study was to know the behavior of the strain under oxidative and thermic stress which take place during dehydration process, as the first step for probiotic dietary supplements development. An economic non-dairy based growth medium (MCM) was formulated for biomass production, which contains high concentrations of phosphate salts (9.2 g/L/64 Mm). In this medium, the immunobiotic CRL1505 accumulates polyphosphate granules (polyP) in the cytoplasm, which was evinced by setting up different techniques, e.g., optical and transmission electronic microscopy; fluorescence; RT-PCR; PAGE; spectrophotometry. The relationship existing between the intracellular accumulation of polyP and the phosphate concentration in the culture medium was established. From these results, two growth conditions MCM and MCM(-) for obtaining cells with high and low polyP content, respectively, were set up. Afterwards, the intrinsic tolerance of the cultures to thermal, oxidative and osmotic stress was evaluated, thus confirming that 9.2 g/L of phosphate salts in the culture medium are required for the stress tolerance observed. The effect of pH and growth phase on both the accumulation of polyP and the tolerance of the cells to heat shock was evaluated in bioreactors (1.5 L). The optimal culture conditions were free pH and stationary phase for obtaining stress tolerant cells. The stress response of the immunobiotic CRL1505 in different heat shock media was evaluated, best results being obtained with MCM3 (pool of inorganic salts) containing Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4 and MnSO4. Once the optimum conditions for biomass production were established, cultures were spray dryed at lab scale using two dry matrix: maltodextrin (powder A) and maltodextrin-MCM3 (powder B). Cell survival was higher in powder B (72.5 %) than in powder A (42.8 %), thus confirming the thermoprotective effect of MCM3. Finally, the biological effect of intracellular extracts of L. rhamnosus CRL1505 containing polyP and a synthetic polyP (control) was evaluated in vivo using a murine model of acute lung inflammation. It was shown that polyPs avoid development of a local inflammatory response in the respiratory tract. In this Doctoral Thesis, different strategies to improve the survival rate of L. rhamnosus CRL1505 to stress conditions involved in the drying process were established: a low-cost culture medium with high inorganic phosphate content; the increase in intracellular polyP; the addition of MCM3 (pool of inorganic salts) in the drying matrix. The potential usage of L. rhamnosus CRL1505 polyP as a novel bioproduct with functional properties is one of the projections of this work.