Actinobacteria poliextremófila: estudio de resistencia a plomo por microscopía electrónica de barrido y análisis genómico

Abstract

Nesterenkonia es un género de Actinobacterias halólas, con sus microorganismos más representativos aislados de ambientes extremos. Estamos particularmente interesados en la cepa Nesterenkonia Act 20 (Act20), que prospera en condiciones extremas en las lagunas de altura Punoandinas en el Andes Centrales de América del Sur, a altitudes superiores a los 3.500 msnm, donde se recibe la radiación UV-B más alta del mundo. Allí se desarrolla la microbiodiversidad con mecanismos únicos de adaptación a la hipersalinidad, desecación, la alta radiación ultravioleta y la presencia de metales pesados. Por otro lado, la contaminación ambiental por plomo (Pb) generada por la actividad industrial es una problemática que crece año a año. El plomo es un metal pesado muy contaminante, tóxico en bajas concentraciones que induce cambios en la conformación de ácidos nucleicos y proteínas, inhibe la actividad enzimática, genera alteraciones en las membranas y en la fosforilación oxidativa. (Bruins et al., 2000, Vallee y Ulmer, 1972). A pesar de su alta toxicidad, muchos microorganismos han desarrollado mecanismos de resistencia al Pb (Jarosławiecka y Piotrowska-Seget, 2014). En trabajos anteriores demostramos que la cepa Act20 exhibe perles de resistencia a plomo y radiación UV-B superiores a los de Nesterenkonia halotolerans (NH), una cepa de referencia procedente de suelos de alta salinidad en China. En este trabajo, buscamos aproximarnos al estudio de la multirresistencia utilizando microscopía electrónica de barrido, y un análisis bioinformático comparando las anotaciones computacionales del genoma de Act20 y NH con el objetivo de identicar genes candidatos que puedan explicar la multirresistencia a condiciones extremas en Nesterenkonia Act20. Se utilizaron cultivos crecidos en medio LB7 de NH y Act20, adicionados con 2 mM de plomo durante 48 hs. Por otro lado, se irradiaron cultivos de ambas cepas durante 20 min con radiación UV-B utilizando una lámpara Vilbert Lourmat VL-4 y se incubó durante 48 horas (estas dosis fueron ensayadas en trabajos anteriores). Posteriormente, se tomaron muestras para microscopía electrónica de barrido, las cuales fueron centrifugadas y lavadas dos veces con buffer fosfato y posteriormente fueron jadas con glutaraldehído 3% v / v. Luego se deshidrataron con soluciones de concentraciones crecientes de etanol (30%, 50%,70%, 90% y 100%) y acetona. La deshidrataciónnal se realizó con la técnica de punto crítico. Luego las muestras se montaron stubs y se metalizaron. Posteriormente se observaron bajo vacío con un microscopio electrónico de barrido. Zeiss SUPRA 55VP (Carl Zeiss NTS GmbH, Alemania) y analizadas químicamente con un espectrómetro Oxford Instrument modelo Inca PentaFETX3. En los cultivos tratados con UV-B observamos abundante material extracelular, estructuras semejantes a nanotubos y agregación bacteriana, esta última más notoria en Act20. En los cultivos tratados con plomo, se observa abundante material extracelular, agregación bacteriana y divisiones incompletas, en NH se destacan algunas estructuras semejantes a nanotubos, y el análisis elemental nos indica la presencia de plomo. Para el análisis bioinformático, realizamos una búsqueda en bases de datos públicas de los genomas en el NCBI, utilizamos el anotador RAST para la anotación de genes, Interpo para el estudio de conservación de arquitectura de dominios. El análisis reveló que el sistema de biosíntesis de ectoína, que incluye las proteínas, etc. A, B, C y D, que son cruciales para la osmoprotección y la absorción de UV-B, están presentes en Act20 y NH. También encontramos que la resistencia a plomo podría estar relacionada con la presencia de 6 genes que codican proteínas putativas involucradas en la respuesta celular frente a plomo, un transportador familiar EamA; P-type ATPasa, transportador ABC, Czcv efÁux, Na+ / H+ antiporter, LipA, esta última está involucrada en la precipitación de Pb2+ en el material extracelular. En cuanto a la reparación de ADN ante daños producidos por UV-B, encontramos la presencia de las fotoliasas BCP Fe-S y CDP. Realizamos una profundización en el estudio de esta última, donde realizamos un análisis de conservación de residuos funcionales, tomando como parámetro una fotoliasa modelo de Agrobacterium tumefanciens, en este estudio se evidencia la presencia de aminoácidos involucrados en la función en Act20, los cuales en su mayoría se encuentran ausentes en NH. Lo cual podría explicar la mayor viabilidad de Act20 frente a radiación UV-B. En conclusión, Nesterenkonia Act20 posee genes de resistencia que le permitirían la viabilidad frente a condiciones extremas y una superioridad con respecto a NH, lo cual está respaldado por experimentos previos in vitro realizados en nuestro laboratorio. En cuanto al análisis de las micrografías, si bien se observan algunas alteraciones morfológicas no hay indicios de colapso y se mantiene la viabilidad en esas condiciones (ensayos previos). Además, la presencia de abundante material extracelular en los cultivos con plomo, podría ser un indicio de que la bacteria está adoptando una estrategia de bioadsorción, dado a que el plomo en muchos microorganismos actúa estimulando la síntesis de exopolisacáridos, actuando este último cómo primera línea de defensa frente al metal pesado (Mathew and Krishnamurthy 2018). Dado a que se trata de un estudio preliminar, es importante destacar que nuestros próximos pasos serán profundizar en las microscopías utilizando la técnica de TEM con EDS para poder detectar la ubicación del plomo, y de ensayos de proteómica para denir las proteínas involucradas en los mecanismos de resistencia.