Producción heteróloga y caracterización de una feruloil esterasa de la cepa probiótica Lactobacillus fermentum CRL1446

Abstract

Las feruloil esterasas (FE) son enzimas que liberan ácidos hidroxicinámicos (AH) a partir de sus formas esterificadas no biodisponibles presentes en alimentos de origen vegetal. Los AH (ácido ferúlico, cafeico, p-cumárico y sinápico) son compuestos fenólicos con numerosas propiedades bioactivas (antioxidantes, hipolipemiantes, hipoglucemiantes). Se ha demostrado que Lactobacillus fermentum CRL1446, productora de FE, incrementa la biodisponibilidad de ácido ferúlico a nivel intestinal, mejorando biomarcadores de síndrome metabólico. El objetivo de este trabajo fue producir y caracterizar la enzima Lf_54 con posible actividad FE de L. fermentum CRL1446. Metodología. Se amplificó por PCR el gen que codifica Lf_54 (GenBank PNV58005.1) y se clonó en el vector pURI3-Cter. La proteína recombinante se hiperprodujo en Escherichia coli BL21 (DE3) y se purificó por cromatografía de afinidad. Su pureza se determinó por SDS-PAGE. La especificidad de sustrato (p-nitrofenil-ésteres de ácidos grasos) y el perfil de sustratos (librería de 43 ésteres comerciales) sobre los que actúa la enzima fueron evaluados por espectrofotometría. La actividad hidrolítica sobre sustratos modelo de actividad FE se determinó por HPLC. El efecto de temperatura, pH, aditivos químicos y un jugo intestinal simulado sobre la actividad esterasa se determinó empleando p-nitrofenil-acetato (pNP-C2). Resultados. Se logró hiperproducir la proteína Lf_54 (33 KDa). La misma presentó mayor especificidad de sustrato frente a pNP-C2. De los 43 ésteres ensayados en la librería, la enzima presentó una mayor actividad hidrolítica sobre sustratos modelo de actividad FE (cafeato, ferulato, p-cumarato y sinapato de metilo), lo cual fue confirmado por HPLC, evidenciando que es una FE. La enzima presentó actividad óptima a 55°C y pH 7 y buena termoestabilidad. Su actividad residual tras incubación en jugo intestinal simulado fue del 90%.Conclusión. Se logró producir y caracterizar bioquímicamente la FE Lf_54 de L. fermentum CRL1446, lo que permitirá su aplicación sobre hidroxicinamatos dietarios, aumentando su biodisponibilidad.