Análisis de sistemas CRISPR en cepas regionales de Streptococcus thermophilus

Abstract

Los fagos, virus que infectan bacterias, existen en todo ecosistema donde aquellas se encuentren presentes. La fermentación con bacterias lácticas (BAL) se emplea para mejorar la conservación de la leche, y se realiza industrialmente en la elaboración de productos de consumo masivo (yogur, leches fermentadas y quesos). Por razones de control y estandarización de calidad, fermentos naturales han sido progresivamente reemplazados por cepas seleccionadas en la industria láctea, lo que convirtió a los fagos en la causa más común de fallas en fermentaciones a gran escala. Streptococcus thermophilus es la especie de BAL más importante en Argentina, y si bien existe una gran variedad de mecanismos bacterianos de fagorresistencia, los sistemas CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) son por lejos los más relevantes en esta especie, siendo muy bien estudiados a escala global. Sin embargo, no hay datos relevantes relativos a cepas regionales, a pesar del uso tan extensivo de S. thermophilus en Argentina. Un locus CRISPR contiene una secuencia líder, y repeticiones (repeats) intercaladas con secuencias cortas (spacers) provenientes de virus u otro ADN invasor. Los spacers incorporados luego de una infección fágica generan moléculas de ARN, que ante la detección de una secuencia específica complementaria de ADN viral forman un complejo con proteínas Cas (CRISPR associated) y lo digieren, impidiendo la infección; de este modo, los CRISPR resultan sistemas inmunes procariotas. En el presente trabajo se analizó la presencia de los sistemas CRISPR conocidos y activos en S. thermophilus (CRISPR1 y CRISPR3), mediante PCR empleando primers universales (CR1F/CR1R y CR3F/CR3R), en 40 cepas aisladas y/o empleadas en nuestro país. De estas, 21 (53 %) poseen el sistema CRISPR1 y 28 (70 %) el sistema CRISPR3, de las cuales 13 (33 %) poseen ambos sistemas. Solo 4 cepas (10 %) no poseen ninguno de los dos sistemas CRISPR. Para todas las cepas positivas, se purificaron los productos de PCR y se secuenciaron (Macrogen, Seúl, Corea). Las secuencias crudas se analizaron y ensamblaron utilizando Staden (v2.0.0b9). La comparación con bases de datos se realizó mediante Nucleotide BLAST. Hasta el momento, se secuenciaron completamente 6 de las 21 cepas positivas para CRISPR1 y 18 de las 28 cepas positivas para CRISPR3. El contenido de spacers para cada cepa fue determinado mediante la herramienta online CRISPR-Cas Finder; el número de spacers varió entre 2 y 23 para CRISPR1 y entre 12 y 20 para CRISPR3. La mayoría de los spacers obtenidos fueron encontrados en genomas de cepas de S. thermophilus presentes en bases de datos online. Los resultados obtenidos permiten conocer los sistemas CRISPR-Cas presentes en cepas regionales de S. thermophilus, como un primer paso destinado a la obtención de cepas con fagorresistencia mejorada de interés para la industria láctea nacional.