Alteración del citoesqueleto de megacariocitos durante la producción de plaquetas inducida por drogas utilizadas en neoplasias mieloproliferativas

Abstract

Previamente reportamos cambios en el diámetro plaquetario máximo (DPM) en pacientes con neoplasias mieloproliferativas crónicas Phi negativas tratados con distintas drogas. Mientras que Anagrelide (ANA),Interferón alfa (IFNa) y Ruxolitinib (Ruxo) indujeron aumento, Hidroxiurea (HU) provocó disminución del DPM. El estudio del citoesqueleto de plaquetas de pacientes demostró alteraciones en la organización de microtúbulos en las plaquetas de mayor tamaño. Mediante estudios in vitro utilizando megacariocitos(MK) provenientes de progenitores hematopoyéticos desangre de cordón umbilical, evaluamos la morfología delas proplaquetas (PP), prolongaciones que se originan en el MK y dan origen a las plaquetas durante el proceso de trombopoyesis, a través de la medición del diámetro de tips y swellings (principales estructuras proplaquetarias). Observamos que ANA e IFNa produjeron aumento del tamaño de estas últimas, mientras que Ruxo e HU no tuvieron este efecto. En el presente estudio profundizamos en las causas de estos cambios a través de dos estrategias: A) Análisis de la morfología del citoesqueleto de MK por inmunofluorescencia indirecta. En las células tratadas con ANA observamos una disminución del porcentaje deMK con polarización de actina (faloidina-FITC) (ANOVAde una vía, p<0.05), lo que sugiere alteración de la formación de la membrana de demarcación necesaria para el inicio de la trombopoyesis, así como desorganización microtubular (anti-alfa tubulina-FITC)(test t apareado p<0.05), lo que interferiría en la elongación de PP. En MK tratados con IFNa se observó desorganización de microtúbulos (p<0.05), mientras quela estructura del citoesqueleto de actina estuvo conservada. B) Para identificar posibles blancos moleculares responsables del efecto de las drogas sobre la estructura del citoesqueleto, se realizó un análisis bioinformático de la expresión génica en MKhumanos tratados con ANA obtenidos por Ahluwalia ycol. (Gene Expression Omnibus database: GSE60621,platform GPL570). Del grupo de genes down-regulados por tratamiento con ANA se seleccionó el CCL5 que codifica para RANTES, citoquina inflamatoria que estimula la formación de PP. En nuestro sistema confirmamos disminución de la expresión de CCL5 porPCR en tiempo real, en MK tratados con ANA respecto al control (test t, p<0.01). IFNa también produjo disminución de la expresión de RANTES (p<0.001)mientras que Ruxo indujo su aumento (p<0.0001). La liberación de RANTES al medio condicionado de MKestuvo disminuida en presencia de ANA (p<0.05),normal en presencia de IFNa, y aumentada con Ruxo(p<0.01). Estos resultados indican una regulación selectiva de RANTES por las distintas drogas estudiadas, y revelan que ANA e IFN, que inducen alteraciones del citoesqueleto de PP, se asocian con disminución de la expresión de RANTES, mientras que Ruxo, que no altera el tamaño de tips y swellings, induce aumento de esta quemoquina. Se encuentran en curso estudios tendientes a identificar las vías de señalización involucradas entre RANTES y el citoesqueletomegacariocítico.