Análisis de fusión de ADNmt para la caracterización de poblaciones africanizadas de Apis mellifera a partir de muestras de miel

Abstract

La variación en el ADN mitocondrial (mitotipo) de Apis mellifera se ha detectado mediante diversos métodos moleculares (RFLPs, PCR-RFLPs y secuenciación) y ha sido utilizada previamente para caracterizar poblaciones africanizadas. El análisis de fusión de alta resolución (HRM) es una técnica novedosa que permite identificar rápidamente polimorfismos de secuencia en amplicones cortos generados por PCR en tiempo real (qPCR). El objetivo de este trabajo fue evaluar la caracterización de poblaciones con mitotipo africano aplicando HRM a partir del ADN presente en muestras de miel. Para esto, se obtuvieron mieles de 111 apiarios ubicados en 13 provincias de Argentina entre 2012 y 2018 y se extrajo ADN del sedimento obtenido por centrifugación de 10 g de miel mediante kit Purelink. Una vez cuantificadas con DeNovix, las muestras fueron sometidas a qPCRs en un volumen final de 20 µl utilizando EvaGreen como intercalante fluorescente y primers (Apis-F/AFR207R) que amplifican un producto de 207pb, que permite diferenciar poblaciones europeas y africanas por HRM. Se usaron controles positivos para abejas europeas (EHB) y africanizadas (AHB) para corroborar los tamaños de los productos de PCR y las curvas de fusión. Además, algunos productos de amplificación fueron purificados y secuenciados para confirmar los haplotipos mitocondriales. Del total de apiarios analizados únicamente 26 ubicados por encima de los 35°S en las provincias de Misiones, La Rioja, Catamarca, Formosa, Corrientes, Córdoba y Santa Fé mostraron mitotipo africanizado. Los apiarios restantes ubicados por debajo este límite, principalmente en las provincias de Buenos Aires, Rio Negro, Neuquén y Entre Ríos, revelaron mitotipo no africanizado. Los resultados obtenidos coinciden con caracterizaciones previas de poblaciones de Apis mellifera en la región. A su vez, la metodología resultó muy sensible y eficiente, ya que puede llevarse a cabo con muy poco ADN y requiere una única reacción de amplificación, reduciendo costos y esfuerzo de muestreo.