Diagnóstico molecular de la infección fúngica invasora

Abstract

El diagnóstico rápido y la identificación de los agentes de infecciones fúngicas invasoras (IFI) es imperativo en pacientes oncohematológicos y trasplantados de órganos sólidos puesto que condicionan el tratamiento. El diagnóstico micológico molecular independiente de cultivo resulta de gran utilidad para detectar un amplio rango de especies causales.El objetivo de este estudio fue evaluar la utilidad de una PCR que amplifica el fragmento ITS2 y su posterior secuenciación para detectar ADN fúngico e identificar el agente causal en muestras clínicas.Se analizaron 135 muestras clínicas de 85 pacientes: 48 pacientes sin IFI o con IFI posible pero sin ningún hallazgo microbiológico y 37 muestras de pacientes con IFI probable o probada, según los criterios EORTC/MSG. Las muestras fueron: 79 de origen respiratorio en 56 pacientes y 56 de otros tejidos y/o líquidos de cavidades de 36 pacientes.Para detectar ADN fúngico se utilizó una PCR estandarizada en un estudio previo (limite de detección 1-2 UFC/mg) que amplifica la región ITS2.El ADN fue extraído con el equipo QIAamp DNA Blood&Tissue (Qiagen), previo tratamiento con liticasa. El ADN de cada muestra clínica fue evaluado concentrado y diluido 1/2 y 1/8, para disminuir el efecto de posibles inhibidores. En cada prueba se incluyó: un control de amplificación (tubo con DNA de A. fumigatus), un control negativo (agua) y un control de inhibición donde se amplificó el gen de la Beta globina humana.Cuando se obtuvo producto de amplificación, este fue purificado y secuenciado en un secuenciador Genetic Analyzer 3500. Para identificar la especie fúngica las secuencias fueron comparadas con las incluidas en las base de datos publica del GenBank utilizando el software BLASTn.La PCR amplificó ADN en muestras de 26 pacientes con IFI y en 8 sin IFI (falsos positivos). Entre estos 8 pacientes, en dos casos la banda amplificada fue débil y no se pudo secuenciar, mientras que las secuencias restantes no fueron de especies fúngicas. En 46 pacientes la PCR fue negativa, y 9 de estos pacientes tenían IFI confirmada por otra metodología (falsos negativos). Los 5 pacientes restantes se excluyeron del análisis porque la PCR fue inhibida.La PCR tuvo 74,3% de sensibilidad (S), 82,2% de especificidad (E) y valor predictivo positivo (VPP) y negativo (VPN) de 76,5% y 80,4%, respectivamente. La secuenciación permitió identificar: Aspergillus S. flavi en 3 casos, Aspergillus S. fumigati en 3, Aspergillus S. nigri en 2, Fusarium sp. en 2, y los siguientes hongos: Candida albicans, A. tamarii, Mucor sp., Rhizopus sp., Rizomucor sp., Penicillium sp., Scedosporium sp., Schizophyllum sp., Saksenaea sp., Exserohilum/Alternaria/Curvularia, Lasiodiplodiasp., C. usitaniae y C. glabrata en 1 casocada uno. En un paciente se detectó ADN de A. S. flavi y C. albicans en pulmón y C. albicans en LCR. En 8 pacientes fue posible identificar el agente en ausencia de cultivos.Esta técnica ensaya tuvo altos valores de S, E, VPN y VPP y permitió identificar los agentes de IFI en ausencia de cultivos.