Purificación y evaluación de la actividad antimicrobiana de un compuesto producido por Lecanicillium sp. LY 72.14

Abstract

Los antimicrobianos sonampliamente utilizados para diversas aplicaciones que van desde bioconservantesy aditivos cosméticos hasta antibióticos empleados para el tratamiento eficazde enfermedades infecciosas. La creciente resistencia de los microoganismos patógenosfrente a los antibióticos convencionales ha fomentado la búsqueda de nuevosantimicrobianos. Frente a este escenario, los programas de bioprospección queinvolucran la búsqueda de microorganismos provenientes de ambientes prístinos opoco explorados constituyen una alternativa interesante para descubrir nuevoscompuestos bioactivos. En este trabajo se purificó un compuesto con actividadantimicrobiana producido por el hongo filamentoso Lecanicillium sp. LY 72.14, aislado de la Eco-región de las YungasTucumanas y seleccionado para este fin. Para ello se procedió a la produccióndel metabolito de interés empleando un medio de cultivo previamente optimizado.La producción sellevó a cabo por cultivo sumergido en un sistema discontinuo, con un inóculo del10% del volumen de trabajo del biorreactor. Una vez concluido el bioproceso, seseparó la biomasa fúngica por centrifugación y el sobrenadante libre de célulasse conservó a 4°C hasta su purificación. La actividad antimicrobiana obtenidaen cada fracción del proceso de purificación fue testeada por el método dedilución crítica. El proceso de purificación consistió primeramente en unaprecipitación en frío con etanol 96° (2:1 v/v, etanol: sobrenadante) a partirdel sobrenadante de cultivo libre de células (800 UA mL -1). Luego,el precipitado (1600 UA mL -1) fue resuspendido en buffer fosfato 20mM pH=7 y sometido a cromatografía de exclusión molecular (SEC) a través de unamatriz de Sephacryl S-300. La fracciónactiva proveniente de la SEC (800 UA mL -1) se concentró yfinalmente se purificó mediante cromatografía líquida de alta performance(HPLC) utilizando un equipo Alliance HPLC e2695 (Waters). El compuesto seinyectó en una columna LC Yarra 3 µm SEC 2000 empleando como fase móvil ungradiente lineal de H2O bidestilada durante 15 min a un flujo de 0,5mL·min-1. La detección del compuesto se realizó por absorbancia UV yse corroboró testeando actividad en los picos colectados. Finalmente, paracorroborar la pureza del compuesto, el pico correspondiente al compuesto deinterés fue reinyectado y re-cromatografiado.