Purificación parcial de una enzima fibrinolítica producida por Bionectria sp. LY 4.1 en condiciones de cultivo sumergido optimizado

Abstract

Las enzimasfibrinolíticas son proteasas que degradan fibrina, la proteína principal queforma los coágulos sanguíneos y cuya acumulación descontrolada conduce atrombosis y diversas enfermedades cardiovasculares, incluyendo infarto agudo demiocardio. Se han realizado diversos estudios en busca de nuevos agentestrombolíticos a partir de bacterias, algas, plantas, gusanos, veneno deserpiente, insectos y hongos. Estos últimos mostraron ser una opción prometedorapara la producción de enzimas fibrinolíticas, ya que las producen en cantidadessignificativas y principalmente de forma extracelular, lo que facilita suextracción/purificación. Estudios precedentes nos permitieron seleccionar a Bionectria sp. LY 4.1 como productor deenzimas con actividad fibrinolítica, y dicha capacidad pudo ser escalada abiorreactor con un medio de cultivo optimizado (MOPT) y bajo condiciones operativasseleccionadas para este fin. En este trabajo se avanzó en la purificación de laenzima mediante precipitación fraccionada a partir del extractocrudo enzimático (ECE) conteniendo actividad fibrinolítica, el que fue obtenidoa partir del caldo de cultivo de Bionectriasp. LY4.1 bajo condiciones optimizadas. Se utilizaron distintos volúmenes(2 y 4 volúmenes) de acetona en frío (-20°C) como agente precipitante. Elprecipitado recuperado (10000 × g / 30 min / 4°C) fue resuspendido en unpequeño volumen de buffer Tris-HCl 50 mM pH 7,8. Se corrieron dos geles nativosen paralelo (ND-PAGE), uno para determinar el perfil proteico de las muestras alo largo del proceso de purificación/concentración y otro, para realizar unzimograma que revele las bandas con actividad fibrinolítica. Adicionalmente, acada una de las fracciones se les determinó concentración de proteínas yactividad fibrinolítica para calcular actividad específica, factor depurificación y porcentaje de recuperación. Los resultados indicaron laconveniencia de precipitar las enzimas fibrinolíticas con 2 volúmenes deacetona, ya que esto condujo a un valor de actividad específica más elevado. Acordea esta metodología, la enzima fue purificada 35 veces con un porcentaje derecuperación del 89%. Aunque esto representaría una etapa preliminar, la queserá complementada con posteriores técnicas cromatográficas, los geles desnaturalizantes(SDS-PAGE) de la enzima parcialmente purificada revelaron una banda única de pesomolecular relativo de ~21 kDa.