An efficient agrobacterium-mediated genetic transformation system in lentil (lens culinaris Medik)

Abstract

Up to date, the transformation frequency in lentil (Lens culinaris Medik) is low. Therefore, the main objective of this study was to optimize an in vitro regeneration system compatible with an Agrobacterium-mediated transformation and to establish the best antibiotic concentration to allow the selection of transformed plants, to develop transgenic lentil plants with higher efficiency. Cotyledonary node explants were transformed with Agrobacterium tumefaciens strain GV2260 harboring binary vector pBI121 with neomycin phosphotransferase (npt-II) and -glucuronidase (gus) genes. A 50 mg L1 kanamycin continuous selection regime was efficient for transformants development as did not affect shoots and roots regeneration in most explants and no escape was observed. Stable integration and expression of transgenes in lentil genome were confirmed by PCR analysis and histochemical assay for -glucuronidase (GUS) enzymatic activity. Wounding of explants, use of an optimized in vitro regeneration protocol, application of high acetosyringone concentration and bacterial density were important to achieve high transformation frequency. Transgenic lentil shoots were produced with an overall frequency of 7%.

Hasta la fecha, la frecuencia de transformación en lenteja (Lens culinaris Medik) es baja. Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio fue optimizar un sistema de regeneración in vitro compatible con una transformación mediada por Agrobacterium y establecer la mejor concentración de antibióticos que permita la selección de plantas transformadas, para desarrollar plantas de lentejas transgénicas con mayor eficiencia. Los explantes de nudos cotiledonales se transformaron con la cepa GV2260 de Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector binario pBI121 con genes de neomicina fosfotransferasa ( npt-II) y -glucuronidasa (gus). Un régimen de selección continua con 50 mg L1 de kanamicina fue eficaz para el desarrollo de transformantes, ya que no afectó la regeneración de tallos y raíces en la mayoría de los explantes y no se observaron emisiones. La integración y expresión estable de los transgenes en el genoma de lenteja se confirmaron mediante análisis de PCR y ensayo histoquímico para la actividad enzimática de la -glucuronidasa (GUS). La herida de los explantes, el uso de un protocolo de regeneraciónin vitro optimizado, la aplicación de una alta concentración de acetosiringona y la densidad bacteriana fueron importantes para lograr una alta frecuencia de transformación. Los tallos de lenteja transgénicos se produjeron con una frecuencia global del 7%