Carboximetilación de queratina obtenida a partir de plumas de pollo

Abstract

Los grandes volúmenes de plumas generados por la industria avícola representan un grave problema ambiental debido a su difícil degradación y disposición final. Las plumas están conformadas en más de 90 % por queratina, una proteína rica en enlaces disulfuro (-S-S-) y en residuos hidrofóbicos, insolubles en agua y en soluciones salinas diluidas. La queratina extraída de las plumas mediante la ruptura de los enlaces disulfuro presentes en la cistina (360 µmol /g pluma), genera la formación de cisteína (720 µmol/g pluma) que contiene grupos ?SH libres[1,2]. La carboximetilación con ácido monocloroacético (MCA) es uno de los métodos más convenientes para introducir grupos carboxílicos en la queratina reducida y minimizar la reformación de enlaces disulfuro, obteniendo como producto S-Carboximetil-queratina. En este trabajo se aplicaron 3 metodologías de solubilización de las plumas: 1) método convencional[1] con 2-Mercaptoetanol (Q2-MEC [0,125 mM], 60 ºC, 1 h, pH 9,0); 2) reducción con sulfuro de sodio[2] (QRed: Na2S [0,1 M], 60 ºC, 1 h y pH= 9); 3) hidrolisis con hidróxido de sodio[3] (QH: NaOH [5 % p/v], 60 ºC, 1 h y pH= 12). En cada caso, después de la solubilización se realizó la etapa de modificación aplicando dos concentraciones (%p/v) de MCA: a) 0,2 % y b) 0,5 % por 1 hora a 25 ºC. El grado de modificación se midió mediante el ensayo de DTNB[4] (Reactivo de Ellman: 5,5´-ditio-bis ácido 2-nitrobenzoico). La determinación del contenido de sulfhidrilos libres (-SH) se realizó calculando la concentración molar a partir de la ecuación de Lambert simplificada A= ε .c .b, donde, A es la absorbancia, c es la concentración molar (mol/L), b el camino óptico medido (cm) y ε es el coeficiente de extinción molar teórico de 13600 M/cm. La concentración de proteína soluble se determinó mediante el método de biuret. La queratina soluble QRed y QH presentaron 360 y 352 umol ?SH/g pluma respectivamente, indicando que la queratina nativa se modificó significativamente (p<0,05) debido a la ruptura del 50 % los enlaces disulfuro presentes en la queratina de plumas de pollo. En el caso de Q2-MEC la concentración de ?SH libres medida fue 388 umol/g pluma correspondiente a un 53 %, ligeramente mayor al reportado en QRed y QH (p>0,05). La carboximetilación de la queratina mediante el agregado de 0,2 y 0,5 % de MCA provocó una reducción significativa del contenido de grupos -SH libres (p<0,05) independientemente de la metodología de solubilización aplicada. Los resultados obtenidos indicaron que el agregado MCA 0,5 % condujo a una modificación de ?SH libres entre 18 y 20 %, significativamente mayor (p<0,05) que el 10 al 14 % de modificación lograda con la adición de 0,2 % de MCA. En cuanto a la concentración de proteína soluble, Q2-MEC tuvo el mayor contenido de proteína soluble (0,67 g queratina/ g de pluma), seguido de QH (0,63 g queratina/ g de pluma; p> 0,05); mientras que QRed la concentración de proteína soluble fue significativamente menor (0,27 g queratina/ g de pluma; p< 0,05). La carboximetilación con 0,2 y 0,5 % MCA llevó al aumento del contenido de proteína en las muestras modificadas, siendo solo significativo (p<0,05) QRed. La carboximetilación de la queratina de plumas de pollo con el agregado MCA 0,5 % (p/v) permitió una mayor modificación de los grupos ?SH libres presentes en la solución, evitando la posible reformación de enlaces ?S-S- y manteniendo el contenido de proteína soluble.