Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares de Lactobacillus

Abstract

Las vesículas extracelulares (EVs) son partículas bilipídicas secretadas por las células en miembros de todos los dominios Eukarya, Bacteria and Archaea. Las EVs bacterianas están involucradas en una amplia gama de funciones desde la patogénesis a la transferencia de genes. La producción de EVs se asoció primeramente a un fenómeno de las bacterias Gram negativas sin embargo recientemente se ha descripto su producción en distintos géneros de bacterias Gram positivas. En particular la presencia de EVs en bacterias probióticas reviste especial interés en cuanto a la funcionalidad o posible utilización médica de las vesículas derivadas de microorganismos con estatus GRAS. El objetivo del presente trabajo es determinar la presencia y caracterizar las EVs de dos especies de lactobacilos probióticos Lactobacillus plantarum CIDCA 83114 y Lactobacillus delbrueckii subsp lactis CIDCA 133. Para la obtención de las EVs las bacterias se crecieron en MRS durante 48 h a 37°C en aerobiosis. Los cultivos fueron centrifugados a 10.000 rpm y filtrados por membrana de 0,45 µm. Los sobrenadantes se concentraron 10 veces por ultrafiltración con una membrana de 5KDa. El sobrenadante concentrado se ultracentrifugó a 130.000 g duran te 1,5 h. El pellet conteniendo las EVs fue resuspendido en buffer Tris (10 mM) azida de Na (0,01%). Se realizó el mismo procedimiento con medio MRS sin bacterias como control. Se determinó tamaño de partícula y se analizó el contenido proteico por Bradford y SDS-PAGE con tinción de Ag. Luego de la purificación se confirmó la presencia de EVs a través del análisis de partículas. Las EVs de L. plantarum CIDCA 83114 mostraron un tamaño promedio de 92,2 nm con un índice de polidispersión (PI) de 0,34; mientras que las EVs de L. delbrueckii subsp lactis tuvieron un tamaño promedio de 90.3 nm y un PI de 0,71. No existieron evidencias de partículas de tamaño regular en el MRS control. Para determinar el contenido de proteínas las vesículas tuvieron que ser concentradas por liofilización. Se obtuvo una concentración promedio de 35,4 ug/ml de proteínas en las EVs de ambos lactobacilos. El análisis de SDS- PAGE reveló bandas diferenciales del MRS control presentes en L. plantarum a los 10, 15 y 20 kDa mientras que en L. delbrueckii estas bandas se encontraron a los 10 y 35 kDa.Los resultados ponen en evidencia la producción de EVs por parte de los lactobacilos estudiados con un tamaño de partícula semejante y una composición de específica de proteínas.