SILVANA IRIS NUDLER

Datos académicos

Lugar de trabajo CONSEJO NACIONAL DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS Y TECNICAS / OFICINA DE COORDINACION ADMINISTRATIVA HOUSSAY / INSTITUTO DE QUIMICA Y FISICOQUIMICA BIOLOGICAS "PROF. ALEJANDRO C. PALADINI" | UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES / FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA / INSTITUTO DE QUIMICA Y FISICOQUIMICA BIOLOGICAS "PROF. ALEJANDRO C. PALADINI"
Título Doctora de la Universidad de Buenos Aires ( Área Ciencias Biológicas)
Grado Universitario de posgrado/doctorado
Especialidad Nuestros resultados preliminares demuestran que las células de cáncer de mama MDA-MB-231 expresan dos transcriptos, L y S, que codifican para la MAPK fosfatasa MKP-3. La isoforma S carece del exón 2 donde se encuentran sitios regulatorios relevantes para el funcionamiento de la enzima. Sin embargo, poco se conoce acerca del comportamiento y del significado biológico de esta variante de splicing. Antecedentes bibliográficos muestran que el páncreas normal presenta un nivel mucho más alto de expresión del transcripto L respecto del transcripto S. Sin embargo, en líneas celulares de cáncer pancreático, el transcripto L se reduce marcadamente y aumenta, a su vez, el transcripto S. Esta reducción del transcripto L sugiere un posible rol de MKP-3 en la carcinogénesis pancreática que podría ser extensible a otros tejidos. En el próximo período nuestro objetivo será evaluar la funcionalidad y el comportamiento de la isoforma S de MKP-3. Para ello, utilizaremos un sistema celular que nos permita sobreexpresar las dos isoformas de la proteína MKP-3 por medio de transfecciones transitorias, lo que nos permitirá modificar sus cantidades relativas y estudiar las consecuencias funcionales que esto genera. Dado que las células de la línea MDA-MB-231 no se transfectan con facilidad (eficiencia de transfección menor al 20%) utilizaremos células de la línea HEK293 (Human Embrionic Kidney), las cuales representan uno de los modelos más ampliamente utilizados para la expresión de proteínas recombinantes, ya que poseen una alta eficiencia de transfección y una maquinaria bioquímica capaz de llevar a cabo el plegado y el procesamiento postraduccional necesario para producir proteínas maduras funcionales. Además, presentan la ventaja de poseer una alta tasa de división y de ser muy sencillas de mantener en cultivo. En los primeros meses del 2015 puse en marcha los cultivos de las células HEK293 y establecí las condiciones de adherencia óptima para realizar los experimentos sin alterar su morfología. Además, realicé experimentos preliminares para chequear la expresión de los dos transcriptos de MKP-3, a partir de los cuales pudimos establecer que ambos transcriptos se expresan en niveles muy bajos y aproximadamente similares. Para sobreexpresar las dos isoformas de MKP-3, los ADNc correspondientes a cada transcripto se clonarán en un vector de expresión bajo el control de un promotor constitutivo, con el propósito de expresar las quimeras flag-MKP-3S y flag-MKP-3L. Esto nos permitirá determinar los niveles de la proteína clonada mediante western blot con un anticuerpo anti-flag, lo cual permite evitar la detección de las isoformas endógenas. Los trabajos del próximo período se focalizarán en la obtención de las construcciones para la expresión de las quimeras y en los estudios bioquímicos que permitan caracterizar su comportamiento y su regulación por pERK. Mediante la sobreexpresión de cada variante analizaremos la capacidad de cada una para defosforilar a ERK1/2 y para regular la proliferación celular. Por otra parte, dado que la expresión de la proteína recombinante se hallará bajo la dirección de un promotor constitutivo, las variaciones que se observen en los niveles proteicos obedecerán únicamente a efectos postraduccionales, evitando cualquier efecto a nivel transcripcional. Mediante este sistema de sobreexpresión podremos determinar si pERK promueve la degradación postraduccional de MKP-3 en sus dos ambas isoformas. Para ello utilizaremos inhibidores de la fosforilación de ERK como el PD98059, entre otros agentes farmacológicos. Por otra parte, continuaré colaborando con el entrenamiento experimental del Lic. JM Cohen, quien comenzará su doctorado en septiembre de 2015 bajo la dirección de la Dra. Cristina Paz.