Empleo de anfibios autóctonos como herramienta bioanalítica de respuestas temprana a la exposición de herbicidas utilizados en agroecosistemas pampeanos

Abstract

El objetivo del presente trabajo de Tesis Doctoral fue evaluar efectos a nivel bioquímico y citogenético inducidos por un nuevo herbicida imazetapir (IMZT) en larvas y adultos de anuros autóctonos, Boana pulchella y Leptodactylus latinasus, asociados a efectos histológicos e individuales, para su posterior incorporación como herramienta bioanalítica de respuesta temprana en programas de monitoreo y diagnóstico ambiental. EL uso intensivo de plaguicidas del modelo agrícola actual es una preocupación para la salud humana y además es propuesto como uno de los factores responsables de la pérdida mundial de la biodiversidad. En particular, las plagas han desarrollado tolerancia a estos agroquímicos y en consecuencia se ha llevado a cabo el desarrollo y la aplicación de nuevos herbicidas. En este contexto, se han desarrollado y comercializado nuevos cultivos tolerantes a herbicidas como sucede en el caso de los cultivos resistentes a imidazolinonas del sistema de producción Clearfield®. IMZT es un herbicida selectivo post-emergente con acción residual miembro de las imidazolinonas utilizado para el control de gramíneas y malezas de hoja ancha en una amplia variedad de cultivos pampeanos. Actualmente, este herbicida ha sido clasificado como compuesto levemente tóxico (Clase III) según la USEPA y la información actual sobre sus efectos ecotoxicológicos en organismos acuáticos es escasa. Por otro lado, la aplicación de herbicidas ha sido propuesta como una de las principales causas influyentes para la disminución de anfibios a nivel mundial. En este sentido, los ecotoxicológicos han buscado diferentes herramientas como los biomarcadores que permitan detectar daños antes que éstos sean irreversibles en los organismos expuestos a plaguicidas. Se conoce que el uso de biomarcadores a nivel citogenético permite detectar respuestas tempranas en anfibios expuestos a concentraciones ambientalmente relevantes de herbicidas. En ese contexto, estos biomarcadores no sólo son recomendados para evaluar la salud de las poblaciones de anfibios sino que además son aceptados como indicadores de la calidad ambiental. Actualmente, existe un consenso en ecotoxicología sobre la necesidad de utilizar biomarcadores específicos a diferentes niveles de organización biológica y generar nuevos biomarcadores con el fin de resolver problemáticas ambientales actuales utilizando especies claves y representativas de ecosistemas perturbados. Con el fin de evaluar la toxicidad del herbicida IMZT y poner a prueba distintos puntos finales en larvas y adultos de B. pulchella y L. latinasus, se llevaron a cabo diferentes tipos de bioensayos utilizando el formulado comercial Pivot® H (10,59 g/l de IMZT) en condiciones controladas de laboratorio (según protocolos estandarizados y propuestos para especies locales) que consistieron en exponer de forma aguda tanto a larvas en diferentes estadios como adultos a posibles escenarios de riesgo para evaluar la respuesta temprana de todos los puntos finales y la potencialidad de IMZT como herbicida emergente, además se llevaron a cabo exposiciones crónicas en larvas de B. pulchella estadio 25 (Gosner) para evaluar la utilidad de los biomarcadores citogenéticos como herramientas de detección temprana, exposiciones para evaluar la capacidad de resiliencia de larvas de B. pulchella estadio 36 (Gosner) luego de una exposición aguda y exposición aguda in vivo y ex vivo para evaluar el tipo de daño que el herbicida induce en el ADN mediante técnicas citogenéticas específicas como el ensayo cometa modificado. Específicamente, se investigaron los efectos letales y subletales ejercidos por el herbicida imazetapir. Para evaluar los efectos letales se calcularon parámetros toxicológicos correspondientes a los valores de la CL50, las curvas de concentración respuesta y los valores LOEC-NOEC. En el caso de los efectos subletales se emplearon puntos finales a diferentes niveles de organización biológica tales como nivel citogenético (micronúcleos – MNs –, anormalidades nucleares y ensayo cometa – EC –), bioquímico (enzimas de estrés oxidativo – CAT y GST – y del sistema colinérgico – AChE –), histológico (histopatología y melanomacrófagos – MMC –) e individual (comportamiento, desarrollo, crecimiento y anormalidades morfológicas). Las respuestas de los puntos finales a IMZT fueron analizados por medio de estadística probabilística utilizando t-test, ANOVA de una vía con test a posterior de Dunnett y ANOVA dos vías, según correspondiera. Con el fin de correlacionar e integrar la respuesta de los biomarcadores en cada especie estudiada se realizaron análisis estadísticos multivariados descriptivos que ayudan a comprender de mejor manera el modo de acción del herbicida en diferentes escenarios de exposición tanto en larvas como en adultos de ambas especies. Finalmente, se obtuvo la curva de sensibilidad de especies y se realizaron estimaciones de sensibilidad entre las diferentes especies pampeanas a IMZT con el objetivo de tener una mejor conocimiento sobre la toxicidad del herbicida en anuros locales. Los resultados de la exposición aguda demostraron que IMZT produce efectos letales con valores de CL5096h = 1,48 mg/l de IMZT para larvas de B. pulchella en ambos estadios de desarrollo y valores de CL5096h = 1,01 y 0,29 mg/l de IMZT para larvas de L. latinasus en estadios de desarrollo 25 y 36 (Gosner), respectivamente. Sumado a esto, se evidenció que otras 7 especies pampeanas en estadio 25 (Gosner) presentan valores de CL5096h entre 0,50 y 1,16 mg/l y esto permitió estimar un valor de concentración peligrosa para especies pampeanas equivalente a 0,53 mg/l de IMZT. Los resultados de los efectos subletales en larvas y adultos de los bioensayos demostraron que todos los biomarcadores utilizados mostraron respuestas por la exposición a IMZT. En particular, para ambas especies en larvas y adultos se evidenciaron efectos cito-genotóxicos por la exposición aguda a IMZT en escenarios reales de concentraciones subletales y dichos efectos fueron detectados por el aumento en la frecuencia de MNs y anormalidades nucleares en eritrocitos y aumentos en la frecuencia del daño en el ADN evidenciada en los nucleoides de células sanguíneas. Por otro lado, se constató que las técnicas citogenéticas aplicadas son útiles para ensayos crónicos ya que responden a bajos tiempos de exposición al herbicida y dichos efectos se detectan antes que se produzcan efectos más severos a nivel individual tal como el retraso en la metamorfosis que se produce a 0,19 mg/l de IMZT. Sumado a esto, a partir de los bioensayos de recuperación se observaron que los daños citogenéticos observados en larvas de B. pulchella a una concentración subletal de 0,39 mg/l de IMZT retornan a niveles basales de valores de daño genético iguales al grupo control luego de 7 días en agua sin herbicida aunque persistan los efectos a nivel individual tales como anormalidades morfológicas y retraso en el estadio de desarrollo. Por último, con los bioensayos citogenéticos para evaluar el tipo de daño en el ADN que produce el herbicida, se detectó que IMZT a concentraciones subletales induce daños oxidativo en bases púricas de larvas de B. pulchella. Además de esto, se constató que IMZT induce alteraciones en el sistema enzimático antioxidante de larvas y adultos de ambas especies. En particular, se observó que IMZT altera significativamente la actividad CAT, GST y AChE en larvas y adultos de B. pulchella a diferentes tiempos de exposición evaluados; mientras que en L. latinasus se observó que sólo GST sufre alteraciones por la exposición a IMZT en larvas pero en adultos se ven afectadas CAT, GST y AChE en diferentes tiempos de exposición evaluados. Los análisis histológicos revelaron aumentos en la frecuencia de MMC por área de hígado en larvas de B. pulchella luego de la exposición aguda a IMZT en un intervalo de concentraciones entre 0,40 y 1,22 mg/l y además se observó la presencia de hígados hipervascularizados en larvas de esta especie expuestas a elevadas de concentraciones de IMZT que variaban entre 1,36 y 1,49 mg/l. Sumado a esto, en adultos de L. latinasus, los resultados demostraron que en diferentes tiempos de evaluación el herbicida IMZT es capaz de inducir alteraciones en el área ocupada por los pigmentos melanina, hemosiderina y lipofuscina de los MMC hepáticos así como también es capaz de provocar lesiones en el hígado tales como hipervascularización y aumentos de los sinusoides hepáticos cuando estas ranas son expuestas a IMZT en posibles escenarios reales de exposición. Finalmente, los estudios de las evaluaciones subletales de los puntos finales demostraron que en altas concentraciones IMZT produce efectos a nivel individual relacionadas a la pérdida de queratodontes en larvas de ambas especies y anomalías en el cuerpo de larvas de L. latinasus, a su vez produce alteraciones en el comportamiento natatorio de ambas especies para tiempos cortos de exposición y efectos en la condición corporal de adultos de ambas especies por disminución del índice de condición corporal en B. pulchella y disminución del índice hepatosomático en L. latinasus cuando ambas especies son expuestas a probables escenarios reales. El análisis multivariado descriptivo permitió corroborar que los biomarcadores evaluados en un mismo nivel de organización biológica están altamente correlacionados y a su vez demostró que existe una progresión de efectos menos severos (detectados a niveles citogenéticos-bioquímicos) a más severos (detectados a niveles histológicos-individuales) conforme aumenta la concentración de IMZT. Los resultados obtenidos de la presente Tesis Doctoral representan una evidencia concreta de que IMZT produce efectos letales y subletales a diferentes niveles de organización en larvas y adultos de especies pampeanas. Además demuestran que el herbicida es un agente oxidativo con capacidad genotóxica, citotóxica y hepatotóxica para anuros y debería ser clasificado según los valores de CL5096h como compuesto tóxico (Categoría II) a muy tóxico (Categoría I), al menos para las especies de anuro pampeanas. Además, se considera que las especies son buenos modelos no sólo para estudios ecotoxicológicos sino también como potenciales bioindicadoras para estudios en ambientes perturbados. Finalmente, se destaca de manera particular que los biomarcadores bioquímicos y citogenéticos empleados en este trabajo a diferentes niveles de organización y de manera integral pueden ser considerados como herramientas válidas de alerta temprana que permitan realizar predicciones sobre efecto letales y subletales irreversibles en futuros estudios ecotoxicológicos así como también en programas de evaluación y monitoreo ambiental en sitios perturbados o con eventos de contaminación.

The objective of this work was to evaluate the cytogenetic and biochemical effects of a novel herbicide imazetapir (IMZT) induced in tadpoles and adults of local anurans—such as Boana pulchella and Leptodactylus latinasus—and to associate those alterations with histologic and corporal changes for later implementation as an early-response bioanalytical tool in environmental-monitoring and diagnostic programs. The intensive use of pesticides in the current agricultural system is a concern for human health and has been proposed as one of the influences responsible for the global loss of biodiversity. In particular, the tolerance pests have developed to those agrochemicals has prompted the development and application of new herbicides. Within this scenario, new herbicide-tolerant crops have accordingly been developed and marketed, as in the example of resistance to the imidazolinones in the Clearfield® production system. IMZT is a post-emergent selective herbicide with the residual action of the imidazolinones used for the control of broadleaf grasses and weeds in a wide variety of pampas crops. Currently, this herbicide has been classified as a slightly toxic compound (Class III) according to United States Environmental Protection Agency (USEPA), and the current information about the compound's ecotoxicologic profile on aquatic organisms is scarce. In addition, the application of herbicides has been proposed as one of the main influential causes of the amphibian decline worldwide. Therefore, ecotoxicologists have been searching for better biomarkers that for their part would allow the detection of damages within the different biologic organizational levels after the exposure to environmental stressors before such alterations become irreversible. In particular, the use of cytogenetic biomarkers in ecotoxicological studies can detect early responses in amphibians exposed to environmentally relevant concentrations of herbicides before the damage becomes too irreversible. Accordingly, those biomarkers are not only recommended for assessing the health of amphibian populations but also have been accepted as indicators of environmental quality. A current consensus on ecotoxicology has been reached regarding the need to use specific biomarkers at different levels of biologic organization and to generate new biomarkers in order to solve current environmental problems through the use of key and representative species within disturbed ecosystems. In view of these considerations, in order to evaluate the toxicity of the IMZT herbicide and to test several endpoints at different biological levels in tadpoles and adults of B. pulchella and L. latinasus, I carried out different types of bioassays using the commercial formulation Pivot® H under controlled laboratory conditions (according to standardized protocols along with other procedures proposed for local species) that consisted in bioassays involving acute exposures to the formulation of tadpoles at different stages as well as adults in three possible risk scenarios to evaluate the early response of all the endpoints and the potential toxicity of IMZT as an emergent herbicide. In addition, I performed a chronic bioassay in B. pulchella tadpoles at (Gosner) Stage 25 to evaluate the utility of cytogenetic biomarkers as tools for early detection in addition to a bioassay to evaluate the resilience in B. pulchella tadpoles at (Gosner) Stage 36 after an acute exposure. Finally, I conducted acute bioassays in vivo and ex vivo in order to assess the type of damage the herbicide induces in the DNA by specific cytogenetic techniques such as a modified comet assay. As a determination of the specific outcome at all levels of the organism, I investigated the lethal and sublethal effects exerted by the IMZT herbicide. To assess lethal effects, I calculated the relevant toxicological parameters such as the LC50 values, the dose-response curves, and the no-observed-effect (NOEC) and lowest-observed-effect (LOEC) concentrations. For determining the sublethal effects, the endpoints chosen were at the different levels of biologic organization—namely, the cytogenetic (i. e., micronucleus formation [MNs], nuclear abnormalities, and the comet assay [EC]), the biochemical (i. e., the antioxidant enzymes catalase [CAT] and glutathione-S-transferase [GST] and the cholinergic enzyme acetylcholinesterase [AChE]), the histologic (histopathology and the presence of melanomacrophages [MMC]), and the corporal (i. e., behavior, development, growth, and morphologic abnormalities). These endpoint responses to IMZT were analyzed by means of probabilistic statistics such as the Student t test, the one-way analysis of variance (ANOVA) with Dunnett's ex-post-hoc test, and the two-way ANOVA, as appropriate. In order to correlate and integrate the biomarker responses in each species studied, descriptive multivariate statistical analyses were performed to help clarify the mode of action of the herbicide in tadpoles and adults of both species under the different exposure scenarios. Finally, the sensitivity curve of the species was obtained and estimations of sensitivity to IMZT made between the two different pampas species in order to gain a more complete understanding of the herbicide toxicity in local anurans. The results of acute exposures demonstrated that the Pivot® H IMZT-based formulation produced lethality at an LC5096h value of 1.48 mg/l of IMZT for B. pulchella tadpoles at both stages (25 and 36) of development and LC5096h values of 1.01 and 0.29 mg/l of IMZT on L. latinasus tadpoles at (Gosner) stages 25 and 36, respectively. In addition, the commercial product was lethal to 7 other Pampean species at (Gosner) stage 25 at a range of LC5096h values between 0.50 and 1.16 mg/l, thus pointing to the conclusion that the equivalent of 0.53 mg/l of IMZT is a dangerous concentration of the product for Pampean anuran species. The results of the sublethal effects on larvae and adults in the bioassays indicated that all the biomarkers used were altered by IMZT exposure. In particular, the tadpoles as well as adults of both species, exhibited alterations in cytogenetic parameters after an acute exposure to IMZT at sublethal concentrations and those changes were detected as an increase in the frequency of MNs and nuclear abnormalities in erythrocytes along with increments in the frequency of DNA damage as evidenced by the EC on the nucleoids of blood cells. Moreover, the cytogenetic techniques applied proved to be useful for chronic trials as those methods reveal responses after short herbicide-exposure times before more severe effects occur at the corporal level, such as the delay in metamorphosis produced at 0.19 mg/l of IMZT. In addition, from the recovery bioassays, the cytogenetic damage observed in B. pulchella tadpoles at a sublethal concentration of 0.39 mg/l of IMZT was found to return to baseline levels equal to those of the control group after 7 days in water in the absence of herbicide although the effects at corporal level—such as morphologic abnormalities and a delay in reaching developmental stages—persisted. Finally, cytogenetic bioassays to assess the type of nucleotide damage revealed that IMZT at sublethal concentrations induced oxidative changes in the purine bases of the B. pulchella–tadpole DNA. Furthermore, IMZT induced alterations in the enzymatic antioxidant system of both tadpoles or adults of both species. In particular, IMZT significantly altered CAT, GST, and AChE activities in B. pulchella tadpoles and adults after the different times of exposure evaluated. In contrast, in the tadpoles of L. latinasus, only the GST underwent alterations after exposure to IMZT; whereas, in the adults, the activity of all three enzymes was affected after those different exposure times. Histological analyses revealed increases in the frequency of melanomacrophages (MMC) per unit area of liver in B. pulchella tadpoles after acute exposure to IMZT in a concentration range between 0.40 and 1.22 mg/l; moreover, the presence of liver pathologies such as hypervascularization was observed at higher IMZT concentrations ranging from 1.36 to 1.49 mg/l. In addition, in the adults of L. latinasus, IMZT induced alterations in the area occupied by the pigments melanin, hemosiderin, and lipofuscin in the hepatic MMCs and was capable of causing liver injury, such as a hypervascularization and an increase in hepatic sinusoids, when those frogs were exposed to IMZT in simulated possible real exposure scenarios. Studies of the sublethal-endpoint evaluations demonstrated that at high concentrations IMZT produced corporal effects related to the loss of keratodonts in tadpoles of both species and abnormalities in the body of L. latinasus tadpoles. IMZT exposure also resulted in alterations in the swimming ability of both species after short times of exposure and could adversely affect the corporal status in the adults of both species as evidenced by a decrease in the body-condition index in B. pulchella and a reduction in the hepatosomatic index in L. latinasus when either species was exposed to concentrations of the product likely encountered under real circumstances in the field. Finally, the multivariate descriptive analysis corroborated that the biomarkers evaluated at the same level of biologic organization were highly correlated and in turn indicated a progression of less severe (detected at cytogeneticbiochemical levels) to more severe (detected at histological-corporal levels) as the IMZT concentration increased. The results obtained from this Doctoral Thesis represent concrete evidence that IMZT produces lethal and sublethal effects at different levels of biologic organization in tadpoles and adults of local anuran species such as B. pulchella and L. latinasus. In addition, the findings demonstrated that the herbicide is an oxidative agent with genotoxic, cytotoxic, and hepatotoxic consequences in the two species studied and, according to the LC5096h values obtained, should be classified anywhere from a Category-II toxic compound to Category-I very toxic one, at least for pampean anuran species. Moreover, the two species studied can be considered good models not only for ecotoxicological studies but also as potential bioindicators for investigations in disturbed environments. Finally, I need to stress that the biochemical and cytogenetic biomarkers used in this work at different levels of biologic organization and in a comprehensive analysis could serve as reliable early-warning indicators to allow predictions of lethal and irreversible sublethal effects for use in future ecotoxicological studies as well as in environmental-assessment and monitoring programs in disturbed or contaminated sites.