Evaluación genotóxica y del daño oxidativo inducido en Cnesterodon decemmaculatus (Pisces:Poecilidae) por herbicidas

Abstract

El objetivo del presente trabajo de Tesis Doctoral fue evaluar los efectos letales y subletales inducidos por dos herbicidas auxínicos ampliamente utilizados tanto en Argentina como en el agro mundial, el dicamba (DIC) y el ácido 2,4-diclorofenoxiacético contenidos en las formulaciones nacionales Banvel® (57,7% DIC) y DMA® (58,4% 2,4-D), respectivamente. Es ampliamente conocido que en las últimas décadas, la cantidad de plaguicidas utilizados en los agroecosistemas aumentó significativamente. La aplicación masiva e intensiva, sumado a falta de regulación del uso de estos agroquímicos representa una preocupación para la salud humana y ambiental, ya que pueden producir múltiples consecuencias negativas a nivel de los organismos, poblaciones, comunidades y ecosistemas perturbando funciones vitales como el comportamiento, reproducción, evasión de predadores y recolección de alimento, entre otros, afectando su la supervivencia y la biodiversidad finalmente de las especies. Los efectos inducidos por los mismos fueron evaluados sobre el poecílido Neotropical Cnesterodon decemmaculatus mediante el empleo de una batería de biomarcadores de efecto tales como letalidad, comportamiento, genotoxicidad y de estrés oxidativo en ensayos agudos de laboratorio. Adicionalmente, se evaluó el efecto letal de las posibles interacciones (aditividad, sinergismo o antagonismo) resultantes de la aplicación conjunta de ambos herbicidas usando mezclas equitóxicas y no equitóxicas de los mismos. Asimismo, se evaluó el efecto genotóxico inducido por DIC y 2,4-D luego de una exposición a largo plazo de los peces a estos herbicidas. Como biomarcador de letalidad se utilizó la determinación de la concentración letal 50 (CL50), la cual en adición a ser un parámetro útil y ampliamente utilizado para establecer la toxicidad de un compuesto, fue empleada para determinar las concentraciones a utilizar en los ensayos subletales a realizar en la presente Tesis Doctoral. Las alteraciones en el comportamiento evaluadas fueron aglomeración en el fondo del acuario (AFA), movimiento lento (ML), reacción lenta (RL) y natación anormal (NA) y se procedió al cálculo de parámetros como NOEC y LOEC para las mismas. En adición, para la evaluación de los posibles efectos genotóxicos se utilizaron diferentes biomarcadores de efecto, como el ensayo de MNs, la inducción de otras anormalidades nucleares y la variante alcalina del ensayo cometa (EC) utilizando células sanguíneas de este poecílido. Posteriormente, se empleó la modificación del EC con enzimas de restricción con el objetivo de determinar el posible mecanismo de acción ejercido por DIC y 2,4-D por tratamiento con endunucleasas Endo III y Fpg, enzimas que detectan oxidación de bases pirimidínicas y púricas, respectivamente. Por otro lado, se analizó la posible respuesta antioxidante inducida por ambos herbicidas auxínicos empleando biomarcadores enzimáticos y no enzimáticos como la detección de variaciones en los niveles de catalasa (CAT), glutatión-S-transferasa (GST) y glutatión (GSH). Adicionalmente, se evaluó la variación en los niveles de acetilcolinesterasa (AChE) como biomarcador de neurotoxicidad. Con el objetivo de analizar las posibles interacciones resultado de la aplicación conjunta de ambos herbicidas y el efecto que podrían ejercer sobre C. decemmaculatus, se realizaron ensayos de toxicidad de mezclas a concentraciones equitóxicas y no equitóxicas de ambos herbicidas. Finalmente, con el objetivo de evaluar el efecto deletéreo a largo plazo ejercido por los herbicidas DIC y 2,4-D, se evaluó la inducción de lesiones primarias en el ADN en células sanguíneas de C. decemmaculatus mediante el EC en ejemplares expuestos de manera crónica a estos herbicidas. Los resultados de los estudios de letalidad revelaron que el formulado Banvel®, produjo efectos letales con un valor de CL5096h de 1639 mg/L mientras que el formulado DMA®, presentó un valor de CL5096h de 1008 mg/L. Luego de la exposición a ambos herbicidas, se observaron alteraciones en los patrones de comportamiento que difirieron significativamente con respecto a los valores controles para los cuatro tiempos de exposición, en el lapso de 0-96 h. Los resultados del ensayo de MNs revelaron un aumento significativo de la frecuencia de MNs a las 48 h de exposición para la concentración más alta ensayada del formulado de DIC (1229 mg/L), pero dicha diferencia no fue observada luego de las 96 h de exposición al mismo. En los peces expuestos a 2,4-D, un aumento significativo fue observado con todas las concentraciones ensayadas, en el rango de 252-756 mg/L, para ambos tiempos de exposición (48 y 96 h). En relación a los resultados del EC, se observó un aumento significativo con respecto a los valores control en el porcentaje de nucleoides dañados y en el índice de daño genético (IDG) tanto para el formulado de DIC como para la formulación de 2,4-D en el rango de concentraciones de 410-1229 y 252-756 mg/L, respectivamente, luego de 48 y de 96 h de exposición. El EC modificado con enzimas de restricción puso en evidencia que las células de los peces que recibieron un post-tratamiento con la enzima Fpg mostraron un aumento significativo del daño oxidativo neto, revelando que ambos herbicidas auxínicos indujeron daño en el ADN mediante la oxidación de purinas. Por otro lado, las muestras que recibieron el post tratamiento con Endo III no mostraron diferencias significativas respecto al grupo control. En cuanto a los resultados de los biomarcadores enzimáticos y no enzimáticos, luego de la exposición tanto a DIC como a 2,4-D, la actividad de CAT y GST aumentó significativamente con respecto a valores controles luego de 48 y 96 h de exposición. El análisis de la actividad de AChE mostró una disminución significativa sólo luego de las 96 h de exposición para ambos herbicidas auxínicos evaluados, pero dicha diferencia no fue observada luego de 48 h de tratamiento. En adición a los biomarcadores enzimáticos evaluados, la actividad de GSH mostró una disminución significativa de su actividad a las 48 para el formulado conteniendo DIC y a las 96 h para el formulado 2,4-D. Los resultados de los ensayos destinados a evaluar la toxicidad y las posibles interacciones resultantes de la mezcla entre los formulados de DIC y 2,4-D, demostraron para mezclas equitóxicas un patrón aditivo entre las mismas, mientras que para mezclas no equitóxicas se observó un patrón sinérgico en las cuatro combinaciones no equitóxicas ensayadas. Finalmente, la evaluación de los efectos genotóxicos inducidos por ambos herbicidas mediante la variante alcalina del EC luego de una exposición crónica empleando concentraciones equivalentes al 2,5% y 5% de la CL5096h, demostró que el DIC fue capaz de inducir lesiones primarias en la molécula de ADN evaluada mediante el EC alcalino luego de 7 y 14 d cuando fue expuesto a una concentración equivalente al 2,5% de la CL5096h, y luego de 7 d a una concentración equivalente al 5% de la CL5096h. Adicionalmente, mediante la misma metodología, el herbicida 2,4-D fue capaz de inducir lesiones primarias en la molécula de ADN luego de los 7, 14, 21 y 28 días de exposición a DIC y 2,4-D. Los resultados de los estudios realizados en el presente trabajo de Tesis Doctoral representan una evidencia concreta que los herbicidas DIC y 2,4-D en sus formulaciones comerciales Banvel® y DMA® deben ser considerados agentes inductores tanto de mortalidad como de efectos subletales tales como alteraciones en el comportamiento, efectos cito y genotóxicos y como agentes capaces de generar alteraciones en el balance oxidativo, tanto enzimáticos y no enzimáticos en C. decemmaculatus. Adicionalmente, estos herbicidas deberían ser clasificados según los valores de CL5096h obtenidos como compuestos nocivos (categoría III) para C. decemmaculatus de acuerdo a los patrones internacionales de clasificación de riesgo toxicológico para especies acuáticas. Es relevante destacar que las concentraciones empleadas en el presente trabajo de Tesis Doctoral se encuentran en el orden de mg/L, mientras que hasta el presente, las detectadas en el ambiente acuático se encuentran en el orden de μg/L. Aun así, ante las condiciones predominantes en el modelo de producción actual y al escaso control gubernamental existente en nuestro país, no podría descartarse la posibilidad de que ambos herbicidas auxínicos, DIC y 2,4-D, puedan ingresar y contaminar los diferentes compartimentos ambientales ejerciendo efectos deletéreos y comprometiendo la salud no sólo para la especie evaluada, C. decemmaculatus, sino también de otros organismos, incluyendo los seres humanos.

The aim of the current Doctoral Thesis was to evaluate the lethal and sublethal effects induced by two auxinic herbicides employed worldwide, dicamba (DIC) and 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) contained in the Banvel® (57.7% DIC) and DMA® (58.4% 2,4-D) formulations marketed in our country. In the last decades, the amount of pesticides used in agroecosystems has significantly increased. The widespread, intensive and non regulated application of these agrochemicals represent a serious concern for human and environmental health, as they can produce multiple consequences at organism, population, community and ecosystem levels, disturbing vital functions of organisms such as behavior, reproduction, predators evasion and food gathering, among others, and thus the survival and biodiversity. The effects induced by these herbicides were evaluated on the Neotropical poecilid Cnesterodon decemmaculatus by biomarkers of lethality, behavior, genotoxicity and oxidative damage under acute laboratory assays. Additionally, the possible interactions (additivity, synergism or antagonism) resulting from the joined application of both herbicides were evaluated by lethality assays using equitoxic and non-equitox mixtures. Furthermore, the genotoxic effect induced by DIC and 2,4-D after a longterm exposure through the alkaline single cell gel electrophoresis assay (SCGE, comet assay) was assayed. The determination of the LC50 was employed as a biomarker for lethality and for determining the concentrations of the sublethal assays in the present Doctoral Thesis. Behavioral changes as gathering at the bottom of the aquarium (GBA), slowness in motion (SM), slow reaction (SR) and abnormal swimming (AS) were evaluated and employed for calculating NOEC and LOEC parameters. In addition, for evaluating the possible genotoxic effects, different biomarkers of effect were employed such as the micronuclei (MNs) test, the induction of other nuclear abnormalities and the alkaline comet assay using blood cells of this poecilid. The modified SCGE methodology with the addition of restriction enzymes was employed in order to determine the possible mechanism of action exerted by DIC and 2,4-D, through the detection of oxidated pyrimidine and purine bases by enzymes Endo III and Fpg, respectively. Moreover, the possible antioxidant response induced by both auxinic herbicides was analyzed using enzymatic and non-enzymatic biomarkers such as the detection of variations in the levels of catalase (CAT), glutathione-S-transferase (GST), acetylcholinesterase (AChE) and glutathione (GSH). In addition, in order to analyze the possible interactions resulting from the joined application of both herbicides and the effect that they could exert on C. decemmaculatus, acute toxicity tests of mixtures were carried out employing equitoxic and non-equitoxic concentrations of both herbicides. Finally, to evaluate the chronic effects induced by the herbicides DIC and 2,4-D, the induction of primary lesions in the DNA in blood cells of C. decemmaculatus was assayed by the SCGE assay. Lethality results revealed that the DIC-based formulation Banvel® exerted lethal effects with a LC5096h value of 1639 mg/L while the 2,4-D-based formulation DMA® had a LC5096h a value of 1008 mg/L. Results of behavioral changes on individuals exposed to DIC and 2,4-D showed significant variations respect to the control values within the 0-96 h exposure range. The results reveal an increased frequency of MNs in those fish exposed to the highest concentration (1229 mg/L) of DIC during 48 h but not in fish exposed to the herbicide for 96 h, regardless of the concentration of herbicide assayed. In 2,4-D- exposed fish, the enhancement in MNs frequency was observed at all concentrations assayed within the range 252-756 mg/L for both exposure times (48 and 96 h). In addition, both herbicides were able to induce single-strand breaks and/or alkali sensitive sites into DNA, revealed by the SCGE assay regardless of the concentration and exposure time. Furthermore, the modified comet assay showed that cells post-treated with the restriction enzyme Fpg showed a significant increase of the oxidative damage, revealing that both auxinic herbicides induced DNA damage through the oxidation of purines. On the other hand, post treatment with restriction enzyme Endo III did not showed significant differences with their respective control group. Regarding the results of the enzymatic and non-enzymatic biomarkers, significant increased activities of the enzymes CAT and GST were observed in fish exposed to DIC- and 2,4-D-based formulations for 48 and 96 h, respectively. The analysis of AChE activity showed a significant decrease only after 96 h of exposure for both herbicides but such difference was not observed after 48 h of exposure. Additionally to the aforementioned altered enzymatic markers, a decrease of GSH was registered in specimens treated for 48 and 96 h with either DIC- and 2,4-D-herbicide formulations. The results of the tests aimed to evaluate the toxic effects exerted when C. decemmaculatus was exposed simultaneously to the DIC- and 2,4-D-based formulations Banvel® and DMA® , respectively, showed for equitoxic mixtures an additive pattern, while for nonequitoxic mixtures a synergistic pattern was observed in the four non-equitoxic combinations tested. Finally, the chronic sublethal effects showed an increased frequency of DNA breaks estimated by the alkaline SCGE in fish exposed to 2.5% of DIC LC5096h for 7 and 14 days whereas this enhancement was observed only after 7 days of exposure to a concentration equivalent to 5% of the LC5096h. In individuals chronically exposed to concentrations equivalent to 2.5 and 5% of 2,4-D LC5096h increased the frequencies of breaks in DNA estimated by the alkaline SCGE in fish exposed for 7, 14, 21 and 28 days. Overall, the results obtained in the present Doctoral Thesis represent a concrete evidence that the auxinic herbicides DIC and 2,4-D present in their commercial formulations Banvel® and DMA ® , respectively, should be considered as oxidizing agents able to induce both mortality and sub-lethal effects such as alterations in behavior, genotoxic effects and alterations of enzymatic and non-enzymatic biomarkers in C. decemmaculatus. Furthermore, these herbicides should be classified according to the values of LC5096h obtained as harmful compounds (category III), for C. decemmaculatus according to the international standards of toxicological risk classification for aquatic species. Given the prevailing conditions in the current agronomic-production model, it cannot be rule out the possibility that both auxinic herbicides can enter and contaminate different environmental compartments, exerting deleterious effects and compromising the health not only of our test species, C. decemmaculatus, but also of other organisms, among which human beings are included.