La fotoinactivacion bacteriana mediada por porfirinas en el tratamiento de las infecciones bacterianas

Abstract

Las enfermedades asociadas a biopelículas bacterianas representan el 80% de las infecciones en humanos. Las infecciones sobre dispositivos médicos implantados resultan un problema clínico de suma importancia, debiéndose la mayoría de ellas, a la formación de biopelículas sobre la superficie de los mismos y la consecuente infección de los tejidos circundantes. La resistencia bacteriana a diferentes antibióticos y la formación de biopelículas dificultan la erradicación de la infección por lo que han emergido otras alternativas terapéuticas como la fotoinactivación bacteriana (FIB). La FIB es un tratamiento donde se emplea una molécula fotosensibilizante (FS), que luego de ser irradiada con luz visible genera especies reactivas del oxígeno con el consecuente daño sobre los microorganismos a eliminar. En la actualidad, la búsqueda de nuevos FS es una prioridad creciente. Hemos diseñado una nueva porfirina sintética, 5,10,15,20-tetrakis [4- (3 - N, N dimetilamoniopropoxi) fenil] porfirina (TAPP), que puede adquirir cargas positivas a pH fisiológico, favoreciendo así la interacción con las biomembranas. La irradiación de cultivos planctónicos de Staphylococcus aureus incubados con TAPP 2,5 μM e irradiados con una fuente de luz blanca con una potencia de 180 J/cm2 indujo la erradicación completa de las bacterias. En cambio, para el tratamiento de biopelículas de S. aureus se requirieron concentraciones más altas de TAPP y mayores dosis lumínicas (TAPP 20 µM y 180 J/cm2 se obtuvo una reducción de alrededor de 3 órdenes de magnitud de UFC/ml). Con el fin de determinar la eficacia de la FIB empleando TAPP en bacterias Gram negativas, se trataron cultivos planctónicos y biopelículas de Pseudomonas aeruginosa. Fueron necesarias concentraciones más elevadas de TAPP para lograr la fotosensibilización de bacterias planctónicas (reducción de 3 órdenes de magnitud de las UFC/ml empleando TAPP 20 μM y 180 J/cm2 ). Por otro lado, altas concentraciones de TAPP no fueron tóxicas per se en las biopelículas de P. aeruginosa (TAPP 30 μM y 180 J/cm2 se obtuvo una reducción de 3 órdenes de magnitud de las UFC/ml en biopelículas). Luego de demostrar que TAPP es un FS prometedor y eficiente, se evaluó esta terapia en un modelo de crecimiento de biopelículas crecidas sobre superficies de titanio de uso odontológico para implantes. Se estudiaron biopelículas de S. aureus, Enterococcus faecalis y Staphylococcus epidermidis crecidas sobre placas de titanio con distintos tratamientos que promueven su osteointegración. Con el fin de potenciar los efectos de la FIB, pre-tratamos las biopelículas con tratamiento fototérmico mediado por láser infrarrojo cercano de 980 nm. La FIB realizada a partir de TAPP a concentraciones entre 0,5 y 5 µM resultó efectiva en la reducción de la viabilidad de las biopelículas de las tres especies estudiadas, reduciendo 2 órdenes de magnitud las UFC/ml en relación a los controles no tratados. El tratamiento previo con el láser de 980 nm, incrementó en un orden de magnitud el efecto bactericida de la FIB sobre las biopelículas. Por otro lado, se evaluó la respuesta a la FIB del ácido 5-aminolevulínico (ALA), precursor de la síntesis de porfirinas fotosensibilizantes, en cultivos planctónicos y en biopelículas de S.aureus, S. epidermidis, Escherichia coli y P. aeruginosa. Además, se cuantificó la cantidad y el tipo de porfirinas sintetizadas en los diferentes tratamientos por determinaciones fluorimétricas y por HPLC. La FIB de S. aureus empleando concentraciones entre 1 y 2 mM de ALA, indujo una reducción de 6 órdenes de magnitud de las UFC/ml en cultivo planctónico y 7 órdenes de magnitud de las UFC/ml de biopelículas empleando una dosis lumínica de 213 J/cm2 . En el caso de S. epidermidis, se logró una reducción de 5 órdenes con una incubación de 3 h con ALA 1 mM y una dosis lumínica de 71 J/cm2 y con ALA 2 mM y una dosis lumínica de 213 J/cm2 , en cultivos planctónicos y en biopelículas, respectivamente. En el caso de P. aeruginosa, mostró sensibilidad a ALA-FIB en el cultivo planctónico, reduciendo su viabilidad en 4 órdenes de magnitud a concentraciones altas de ALA (40 mM). En cambio E. coli, a pesar de presentar acumulación de porfirinas, no pudo ser fotoinactivada, cuestionando así el paradigma de que la falta de respuesta a la FIB en bacterias Gram negativas se debería a la escasa incorporación de FS en estas células. El análisis por HPLC de las porfirinas sintetizadas a partir ALA demostró que las mismas son dependientes de la concentración, el tiempo de incubación y la bacteria empleada. Estos perfiles cambian drásticamente con las condiciones de tratamiento y en consecuencia, se observan diferencias en la respuesta a la FIB. Por lo cual, concluimos que es de suma importancia la optimización de las variables en cada tratamiento. En conclusión, los resultados obtenidos indican que la FIB a partir de TAPP resultaría un tratamiento efectivo en la eliminación de bacterias formadoras de biopelículas sobre superficies de titanio empleadas en implantes de uso clínico, odontológico especialmente. El pre tratamiento fototérmico sensibilizaría las biopeliculas a los efectos de la FIB. Además, se ha demostrado la eficacia que posee el tratamiento, empleando ALA en cultivos planctónicos y biopelículas de bacterias Gram positivas y negativas. Por último, se ha concluido que la sensibilidad a este tratamiento está directamente relacionada con el patrón y la cantidad de porfirinas sintetizadas. La FIB tanto a partir de porfirinas sintéticas como endógenas, es un tratamiento prometedor para el control de infecciones bacterianas, especialmente por bacterias Gram positivas, mientras que es necesario mejorar la eficiencia sobre las Gram negativas.