Escherichia coli verotoxigénico: identificación de clones nativos circulantes y caracterización de su virulencia como indicadores moleculares del potencial riesgo en salud pública

Abstract

Escherichia coli verotoxigénico (VTEC) es un patógeno asociado a enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) que causa infecciosas severas en los humanos como diarrea, colitis hemorrágica (CH) y síndrome urémico hemolítico (SUH). El SUH afecta mayormente a niños menores de 5 años, es la principal causa de insuficiencia renal aguda, una de las más importantes de insuficiencia renal crónica, y puede causar la muerte. Argentina posee la mayor incidencia a nivel mundial de SUH y una alta prevalencia de VTEC en bovinos y alimentos derivados. El ganado bovino y los alimentos cárnicos son el principal reservorio y fuente de infección de VTEC, respectivamente.Las verotoxinas son el principal carácter de virulencia pero existen otros factores asociados a la patogénesis por VTEC, algunos de ellos codificados en islas de patogenicidad (PAI). La evaluación de los genes de virulencia contenidos en las PAI es una nueva herramienta para determinar el potencial riesgo de estas cepas en la salud pública, ya que éstas desempeñan un papel importante en la patogenicidad de la VTEC. Una evaluación de riesgo molecular (MRA) basada en la evaluación del contenido de genes nle se ha utilizado para predecir qué cepas representan un riesgo para los seres humanos.La clasificación de VTEC utilizando métodos filogenéticos ha mostrado que algunos serotipos se agrupan de acuerdo a su impacto en salud pública. Uno de estos métodos es la tipificación de secuencias de múltiples loci o MLST, el cual puede contribuir a establecer el riesgo que algunos aislamientos pueden presentar para la salud pública. Por otro lado, la identificación de los clones/linajes es importante ya que varias características, entre ellas la propensión a causar enfermedades, varía con el origen filogenético de VTEC. En relación a la diversidad filogenética y a la similitud con clones existentes en otras partes del mundo, asociados a enfermedad en seres humanos, no hay estudios previos realizados en cepas VTEC nativas, por lo cual, se desconocen qué clones de VTEC, especialmente no-O157:H7, están circulando en Argentina. El objetivo de esta tesis fue caracterizar la diversidad genética de las cepas VTEC no-O157:H7 nativas aisladas de diversas fuentes, principalmente ganado bovino y alimentos, identificar qué clones están circulando en el país para determinar las relaciones filogenéticos entre las cepas y compararlas con cepas de diferentes orígenes geográficos, especialmente con aquellas de casos clínicos en humanos, y evaluar las características relacionadas con virulencia de los mismos, con el fin de identificar el potencial riesgo que estas cepas pudieran tener para la salud pública.Para llevar a cabo este objetivo, se determinó el secuenciotipo (ST) de 59 aislamientos VTEC pertenecientes a 42 serotipos mediante MLST. Por otro otro lado, se determinó la distribución de genes ubicados en las PAI OI-36 (nleB2, nleC, nleD, nleH1-1), OI-57 (nleG2-3, nleG5-2, nleG6-2), OI-71 (nleA, nleF, nleG, nleG2-1, nleG9, nleH1-2), y OI-122 (nleB, nleE, ent/espL2, Z4321, Z4326, Z4332, Z4333) en 204 aislamientos de bovinos, alimentos y seres humanos pertenecientes a 52 serotipos no-O157:H7 y, en las cepas que resultaron positivas para el gen nleB, se determinaron sus niveles de expresión mediante reacciones de cuantificación relativa por PCR en tiempo real.En cuanto a la caracterización de los genes codificados en PAI, se encontraron diferencias en la frecuencia de los marcadores genéticos y una gran diversidad de perfiles de virulencia. En la mayoría de las cepas eae-negativas, solo estuvo presente el módulo 1 (Z4321) de OI-122. Sin embargo, se detectaron algunas cepas eae-negativas inusuales, que presentaron además de Z4321 otros genes de las PAI estudiadas. El análisis de agrupamiento, sin tener en cuenta los aislamientos que resultaron negativos para todos los genes, definió dos grupos principales: i) aislamientos eae-negativos (caracterizado por incluir seropatotipos -SPT- D, E o sin determinación, y aislamientos de origen bovino o alimentos); ii) eae-positivos (principalmente caracterizado por incluir aislamientos pertenecientes a SPT B, C, o no determinado).El análisis de MLST utilizando la base de datos EcMLST identificó 38 ST, de los cuales 17 (45%) fueron nuevos (algunos de ellos con alelos aún no registrados), en 18 serotipos. Quince de los 38 ST identificados se agruparon en 11 grupos clonales (CG) y 23 no fueron agrupados en ninguno de los CG definidos. En algunos serotipos, se determinaron diferentes ST. Los resultados mostraron un alto grado de heterogeneidad filogenética entre las cepas estudiadas, que varios de los aislamientos de bovino y alimentos pertenecieron a los mismos ST que comúnmente se asocian con casos clínicos en humanos en diversas áreas geográficas y la presencia de numerosos linajes emergentes en la región.De acuerdo a los análisis de expresión basal relativa del gen nleB se encontraron niveles de expresión heterogéneos entre las cepas estudiadas. No se encontraron diferencias significativas en los niveles de expresión asociadas al origen de los aislamientos (bovino y humano) ni al serotipo pero si entre el grupo proveniente de SUH y el no-SUH. Por otro lado, aislamientos no-O157:H7 pertenecientes a los serotipos O145:NM (bovino y humano) y O146:H21 (bovino) presentaron niveles de expresión de nleB superiores al control, una cepa O157:H7 aislada de un niño con SUH.En base al esquema de MRA analizado, los aislamientos eae-positivos con mayor potencial de virulencia fueron aquellos pertenecientes a los serotipos O5:NM, O26:H11, O38:H39, O111:H2, O118:H2/H16, O121:H19, O145:NM, O146:H21 y O165:NM. En relación a los aislamientos eae-negativos, se plantea la necesidad de utilizar marcadores adicionales que permitan predecir el potencial riesgo de causar enfermedad en seres humanos.VTEC representa un grave problema para la salud pública. Argentina tiene la mayor incidencia de SUH en el mundo y este estudio proporciona los primeros datos sobre los clones VTEC no-O157:H7 que están circulando en nuestra región. Los resultados mostraron que algunos de ellos pueden representar un alto riesgo zoonótico y esta información es importante para desarrollar iniciativas en salud pública.

Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) is a pathogen associated with foodborne diseases that causes severe infectious diseases in humans such as diarrhea, hemorrhagic colitis (HC) and haemolytic uraemic syndrome (HUS). HUS mainly affects children under 5 years old, it is the main cause of acute renal failure, one of the most important causes of chronic renal failure and it can cause death. Argentina has the highest incidence worldwide with high frequency and prevalence of VTEC in bovines and derived foods. Cattle and meat foods are the main reservoir and source of VTEC infection, respectively. Verotoxins are the main virulence character but there are other factors associated with VTEC pathogenesis, some of them encoded in pathogenicity islands (PAIs). The evaluation of virulence genes in PAIs is a new tool to determine the risk potential of these strains in public health since they are played an important role in the pathogenicity of VTEC. A molecular risk assessment (MRA) based on the evaluation of gene content has been used to predict which strains pose a risk to humans. The classification of VTEC using phylogenetic methods has shown that some serotypes are grouped according to their impact on public health. One of these methods is the multilocus sequence typing or MLST, which can contribute to establishing the risk that some isolates can present for public health. On the other hand, the identification of clones/lineages is important since several characteristics, among them, the propensity to cause diseases, is related to the phylogenetic origin of VTEC. In this case, there are no previous studies carried out on native VTEC strains, so it is unknown which clones of VTEC, especially non-O157:H7, are circulating in Argentina. The objective of this thesis was to characterize the genetic diversity of native VTEC nonO157:H7 strains from diverse sources, mainly cattle and food, identify which clones are circulating in the country to determine the phylogenetic relationships between strains, compare them with strains of different geographical origins, especially with clinical cases strains, and evaluate the characteristics related to the virulence of them, in order to identify the potential risk that these strains have for public health. To carry out our objective, the sequence types (STs) in a total of 59 VTEC isolates belonging to 42 serotypes were determined using MLST. On the other hand, the distribution of genes in PAIs OI-36 (nleB2, nleC, nleD, nleH1-1), OI-57 (nleG2-3, nleG5-2, nleG6-2), OI-71 (nleA, nleF, nleG, nleG2-1, nleG9, nleH1-2), and OI-122 (nleB, nleE, ent/spL2, Z4321, Z4326, Z4332, Z4333) were analyzed in 204 isolates of bovines, humans and food belonging to 52 nonO157:H7 serotypes and, in the strains that were positive for the nleB gene, their expression levels were determined by means of relative quantification reactions by real-time PCR. Regarding the characterization of the genes encoded in PAIs, differences in the frequency of genetic markers and a great diversity of virulence profiles were found. In most of the eaenegative strains, only module 1 (Z4321) of OI-122 was present. However, some unusual eaenegative strains were detected, which presented in addition to Z4321 other genes of the PAIs studied. The cluster analysis, without taking into account the isolates that were negative for all the genes, defined two main groups: i) eae-negative isolates (characterized by including seropathotypes -SPTs- D, E or without determination, and bovine or food isolates); ii) eaepositive (mainly characterized by including isolates belonging to SPTs B, C, or not determined). The MLST analysis using the EcMLST database identified 38 STs, of which 17 (45%) were new STs (some of them with alleles not yet registered), in 18 serotypes. Fifteen of the 38 STs identified were grouped into 11 clonal groups (CGs) and 23 were not grouped in any of the CGs defined by the database. In some serotypes, different STs were determined. The results showed a high degree of phylogenetic heterogeneity among the strains studied, that several cattle and food isolates belonged to the same STs that are commonly associated with clinical cases in humans in different geographical areas and demonstrated the presence of numerous emerging lineages in the region. According to the relative basal expression analyzes of the nleB gene, heterogeneous expression levels were found among the strains studied. No significant differences were found in the levels of expression associated with the origin of the isolates (bovine and human) or serotype but did between the group from HUS and non-HUS. On the other hand, isolates non-O157 belonging to the serotypes O145:NM (cattle and human) and O146:H21 (cattle) presented higher nle expression levels than the control sample, a strain O157:H7 isolated from a child with HUS. Based on the MRA scheme analyzed, eae-positive isolates with increased virulence potential were those belonging to serotypes O5:NM, O26:H11, O38:H39, O111:H2, O118:H2/H16, O121:H19, O145:NM, O146:H21 y O165:NM. Regarding to eae-negative isolates, the need to use additional markers to predict the potential risk of causing disease in humans is proposed. VTEC represents a serious problem for public health. Argentina has the highest incidence of HUS in the world and this study provides the first data about the non-O157: H7 VTEC clones that are circulating in our region. The results showed that some of them could represent a high zoonotic risk and this information is important to develop public health initiatives.