Control de la fasciolosis: Rol de las enzimas de fase II de detoxificación en la resistencia al Triclabendazole y evaluación de la inmunogenicidad y protección conferida por la proteína recombinante GST Mu (rFhGSTMu) contra Fasciola hepatica en el modelo

Abstract

Fasciola hepatica es el agente causal de la fasciolosis, enfermedad parasitaria zoonótica. Desde un punto de vista productivo, la enfermedad cobra relevancia en la cría de ovinos y bovinos en diferentes partes del mundo, incluidas amplias regiones de la Argentina. De las diferentes medidas de control disponibles, el tratamiento químico es el más utilizado. Si bien se conocen distintos grupos químicos, el triclabendazole (TCBZ) ha sido el compuesto de elección en ovinos y bovinos debido a que el mismo presenta una elevada eficacia sobre estadios inmaduros y maduros de F. hepatica. El uso indiscriminado de estos compuestos químicos en diferentes regiones del mundo ha generado una importante presión de selección, reportándose el desarrollo de cepas de F. hepatica resistentes a la mayoría de los fasciolicidas, especialmente a TCBZ. En este contexto, la vacunación aparece como una herramienta interesante para el control de este parásito. Las enzimas Glutatión S-Transferasas (GSTs) son el principal sistema de detoxificación de fase II en parásitos helmintos. Se ha demostrado que F. hepatica presenta niveles elevados de GST con funciones fisiológicas importantes. En el presente proyecto de Tesis se evaluó la expresión y actividad de enzimas de las diferentes vías metabólicas de detoxificación involucradas en el proceso de metabolización de TCBZ de Fase I: Carboxil estearasa (CE) y de Fase II: Glutation S-Transferasa, Glutatión Peroxidasa y Glutatión Reductasa (GSR) por parte de diferentes cepas de F. hepatica susceptible y resistentes a TCBZ. Se detectó una respuesta multienzimática que involucra a toda la familia de enzimas dependientes de glutatión (GSH). La enzima CE no expresó diferencias significativas entre las cepas evaluadas. Dicha enzima no estaría involucrada en el fenómeno de resistencia. Se demostró que la actividad citosólica es aproximadamente 50% más efectiva en las GSTs correspondientes a cepas resistentes a TCBZ. Cuando se analizaron las diferentes isoenzimas se determinó que la isoenzima Mu no solo está implicada en los fenómenos de detoxificación sino que además participaría en el fenómeno de resistencia antihelmíntica. Al evaluar el grado de implicancia de dicha isoenzima Mu, hemos identificado y caracterizado genéticamente el gen GST Mu aislado de las cepas de F. hepatica susceptible (TCBZ-S) y resistente (TCBZ-R) a TCBZ. Se detectó una mutación en el gen la cual modifca el aminoácido 143 de la isoenzima GST Mu en la cepa TCBZ-R pudiendo ser la misma parte responsable de la sobreexpresión del sistema enzimático metabólico en estudio. Teniendo en cuenta la relevancia de GST Mu, se detectó por PCR el gen correspondiente a esta isoenzima y se envió a sintetizar la proteína recombinante (rFhGSTMu). Se confirmó su pureza por SDS-PAGE y se evaluó su actividad enzimática. Para cumplir con el otro objetivo de la Tesis, se estableció el número de metacercarias de F. hepatica para evaluar la actividad protectora de rFhGSTMu formulada en tres adyuvantes distintos contra F. hepatica en ratones Balb/c. Los animales fueron inmunizados en tres oportunidades cada 15 días por la via subcutánea con las siguientes formulaciones: rFhGSTMu+ Adyuvante de Freund Incompleto, rFhGSTMu+ Hidróxido de Aluminio (Al(OH)3), rFhGSTMu+ Quil A y Grupo Control (sin inmunizar). Se detectaron niveles de anticuerpos IgG y subisotipos (IgG1 e IgG2a), IL-4 e IFN-γ. Todas las formulaciones vacunales indujeron anticuerpos IgG específicos con una respuesta mixta IgG1/IgG2a (Th2//Th1), sin embargo, la formulación rFhGSTMu + Al (OH)3 estimuló principalmente un perfil Th2 coincidente con una mayor producción de IL-4 en comparación con IFN-γ. La formulación rFhGSTMu+ Al(OH)3 redujo entre 75-90% el número de parásitos y la diferencia en la curva de supervivencia de este grupo fue altamente significativa. En el resto de los grupos experimentales, el recuento de parásitos fue similar al grupo control no inmunizado con una reducción en el número de parásitos no mayor al 12,5%. El daño hepático se estimó indirectamente mediante la determinación de los valores séricos de las enzimas aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), fosfatasa alcalina (FA) y por análisis histopatológico de las lesiones. Los valores de las enzimas hepáticas en el grupo inmmunizado con rFhGSTMu+ Al(OH)3 fueron significativamente más bajos (p<0,05) que los valores registrados en el grupo control y en el resto de los grupos experimentales. Los resultados obtenidos en la presente Tesis indican que la proteína recombinante rFhGSTMu formulada con Al (OH)3 es un candidato vacunal contra F. hepatica en el modelo murino.

Fasciola hepatica is the causative agent of fasciolosis, a zoonotic parasitic disease. From a productive point of view, the disease becomes relevant in the breeding of sheep and cattle in different parts of the world, including many regions of Argentina. Among the different control measures available, chemical treatment is the most used one. Although different chemical groups are known, triclabendazole (TCBZ) remains the compound of choice in sheep and cattle because it has a high efficacy against immature and mature stages of F. hepatica. The indiscriminate use of these chemical compounds in different regions of the world has generated an important selection pressure, and the development of strains of F. hepatica resistant to most fasciolicides, especially to TCBZ, has been reported. In this context, vaccination appears as an interesting tool for the control of this parasite. The enzymes Glutathione S-Transferases (GSTs) are the main phase II detoxification system of helminth parasites. It has been demonstrated that F. hepatica exhibits high levels of GST with important physiological functions. In this thesis project, the expression of the different metabolic pathways of Phase I and II detoxification enzymes involved in the metabolism of TCBZ were evaluated. Phase I enzyme carboxyl esterase (CE) and phase II enzymes Glutathione S-Transferase, Glutathione Peroxidase and Glutathione Reductase (GSR) were evaluatedevaluated in different strains of F. hepatica susceptible and resistant to TCBZ. A multienzyme response was detected that involves the whole family of enzymes dependent on GSH. CE did not exhibit significant differences between strains. This could be due to a lack of involvement of this enzyme in the resistance phenomenon. It was demonstrated that the cytosolic activity is approximately 50% more effective in the GST corresponding to strains resistant to TCBZ. When the different isoenzymes were analyzed, it was determined that the Mu isoenzyme is not only involved in the detoxification phenomena but also participates in the anthelmintic resistance phenomenon. In evaluating the degree of implication of this Mu isoenzyme, we have identified and genetically characterized the Mu GST gene isolated from strains of F. hepatica susceptible (TCBZ-S) and resistant (TCBZ-R) to TCBZ. A gene mutation was detected which modifies the amino acid 143 of the isoenzyme GST Mu in the TCBZR strain, which could be responsible for the overexpression of the metabolic enzyme system under study. Given the probable relevance of GST Mu, a recombinant protein corresponding to the gene coding for said enzyme was generated. For this, the gene corresponding to GST Mu was detected by PCR, and the corresponding recombinant protein (rFhGSTMu) was then synthesized, expressed and purified. It was evaluated electrophoretically and the enzymatic capacity of rFhGSTMu was confirmed. In order to comply with the other objective of the Thesis, the number of metacercariae of F. hepatica was established to evaluate the protective activity of rFhGSTMu formulated in three different adjuvants against F. hepatica in Balb/c mice. The animals were immunized three times every 15 days by the subcutaneous route with the following formulations: rFhGSTMu+ Incomplete Freund's Adjuvant, rFhGSTMu+ Aluminum Hydroxide, rFhGSTMu+ Quil A and Control Group (without immunizing). Levels of IgG antibodies and sub-types (IgG1 and IgG2a), IL-4 and IFN-γ were detected. All the vaccine formulations induced specific IgG antibodies with a mixed IgG1 / IgG2a response (Th2 // Th1), however, the formulation rFhGSTMu+ Al (OH)3 mainly stimulated a Th2 profile coincident with a higher production of IL-4 compared with IFN-γ. The rFhGSTMu+ Al (OH)3 formulation reduced between 75-90% the number of parasites and the difference in the survival curve of this group was highly significant. In the rest of the experimental groups, the parasite count was similar to the non-immunized control group with a reduction in the number of parasites not greater than 12.5%. Liver damage was estimated indirectly by determining the serum values of the enzymes aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (FA) and by histopathological analysis of the lesions. The liver enzyme values in the group immunized with rFhGSTMu+ Al (OH)3 were significantly lower (p<0.05) than the values recorded in the control group and in the rest of the experimental groups. The results obtained in this thesis indicate that the recombinant protein rFhGSTMu formulated with Al (OH) 3 is a vaccine candidate against F. hepatica in the murine model.