Estudios sobre la población de receptores hormonales en neoplasias mamarias caninas y evaluación in vitro de terapias adyuvantes

Abstract

Las neoplasias de la glándula mamaria representan el tumor más frecuente en perras enteras, siendo la edad media de aparición entre los 8 y 10 años. Las hormonas esteroides sexuales, principalmente estrógenos y progesterona, representan el principal factor de riesgo para su desarrollo, y la castración antes del segundo celo reduce el riesgo de aparición de esta neoplasia. Se ha demostrado la presencia de receptores a estrógenos (RE) y progesterona (RP) en los tumores mamarios caninos, siendo esta expresión mayor en tumores benignos comparada con tumores malignos. Sin embargo, la asociación de los RE y RP con factores clínico - patológicos, así como su valor pronóstico, se encuentran en discusión. Por otra parte, algunos estudios en humanos han revelado que además de las clásicas hormonas sexuales, otras hormonas parecen estar involucradas en el desarrollo y/o progresión de esta neoplasia. Así, se ha demostrado la presencia de los péptidos oxitocina y vasopresina, así como de sus receptores en líneas celulares de cáncer mamario humano y en carcinomas primarios de mama humanos. En la perra, al momento se desconoce la presencia de receptores a estas hormonas en los tumores mamarios. La extirpación quirúrgica del tumor representa el tratamiento de elección para todas aquellas perras con neoplasias mamarias. Sin embargo, existe un elevado número de pacientes en los que la cirugía no es suficiente para lograr la curación, o pacientes en los que la realización de la cirugía no es posible, por lo que se hace necesaria la búsqueda de terapias adyuvantes a la cirugía o paliativas. Trabajos sobre líneas celulares de cáncer mamario humano, así como estudios in vivo sobre modelos murinos de cáncer mamario, han demostrado que la oxitocina y la desmopresina (análogo sintético de la hormona vasopresina) tienen la capacidad de modular el crecimiento de las células tumorales. En la perra, al momento se desconocen los efectos de estos péptidos sobre líneas de cáncer mamario canino. Por lo tanto, la presente tesis de doctorado tuvo como objetivo general aportar conocimientos acerca de la influencia del componente hormonal sobre el desarrollo de los tumores mamarios caninos, mediante el estudio de la población de receptores a hormonas esteroideas, oxitocina y vasopresina en el tejido mamario tumoral canino y la evaluación de los posibles efectos antitumorales de péptidos en una línea celular de cáncer mamario canino.En la primera parte de la tesis doctoral se realizó una caracterización clínica y patológica de 65 tumores mamarios caninos recolectados. El estudio reveló una edad promedio de aparición de esta neoplasia de 9,4 años, indicando que ocurre mayormente en perras de edad media a adulta. Asimismo, la mayor parte de las perras se encontraban enteras al momento del diagnóstico, lo cual brinda mayor sustento al rol fundamental que tienen las hormonas esteroides sexuales en el desarrollo de los tumores mamarios. El análisis histológico mostró que el 60% de las neoplasias fue de naturaleza maligna, siendo el carcinoma túbulo-papilar el más frecuentemente diagnosticado. El restante 40% de los tumores fue de naturaleza benigna, siendo el adenoma (simple y complejo) el tipo más comúnmente hallado. El estudio inmunohistoquímico del receptor a estrógenos α (REα) permitió visualizar una mayor expresión en tumores benignos en comparación con malignos. Asimismo, en el grupo de tumores malignos, se observó una mayor expresión en carcinomas del tipo túbulo-papilar, así como en carcinomas de Grado Histológico de Malignidad (GHM) I. Estos resultados dan mayor sustento a la hipótesis de que la presencia del REα se pierde conforme el tumor progresa hacia la malignidad, y que su expresión en tumores malignos se relaciona con características de baja malignidad tumoral. También se estudió la expresión del receptor a estrógenos β (REβ), observándose que su expresión ocurrió de manera similar tanto en tumores mamarios benignos como malignos. Dado que no se observó asociación alguna con los factores de valor pronóstico analizados para tumores malignos, en la presente tesis no se pudo establecer su rol en las neoplasias mamarias en caninos. Además, se estudió la presencia del RP en tumores mamarios benignos y malignos, observándose una baja expresión en ambos tipos tumorales. Cuando se evaluó su asociación con los factores clínico-patológicos, se observó una mayor expresión del RP en perras que se encontraban en estadíos clínicos IV y V, permitiendo sugerir que los agentes antiprogestágenos podrían ser de utilidad en casos de cáncer mamario avanzado. Por otro lado, en la segunda parte de la presente tesis se demostró la presencia del receptor a oxitocina (ROT) en los tumores mamarios caninos analizados, hallazgo que representa el primer reporte acerca de la expresión de este receptor en esta neoplasia en la especie canina. El ROT se expresó tanto en tumores benignos como malignos, y en estos últimos, su expresión fue mayor en carcinomas de GHM I y II, y tendió a ser mayor en los tumores malignos positivos para el REα. Sin bien se necesitan mayores estudios al respecto, se podría especular que, al igual que ocurre con otros receptores a hormonas, la presencia del ROT en el tumor estaría asociada con factores indicadores de buen pronóstico. Del mismo modo, los resultados del estudio inmunohistoquímico para el receptor a vasopresina V2 (RAVP V2) revelaron que el total de los tumores mamarios caninos analizados resultaron positivos a este receptor, siendo su expresión elevada en todos los casos. Para nuestro conocimiento, esta es la primera vez que se reporta la presencia de este receptor en las neoplasias mamarias en caninos, y reviste importancia a la hora de utilizar moléculas como la desmopresina, con efectos antitumorales y antimetastásicos conocidos, cuyas acciones se ejercen a través del RAVP V2. Considerando la necesidad de investigar nuevas y más eficaces alternativas terapéuticas para el tratamiento de los tumores mamarios en caninos, en la tercera parte de la presente tesis se evaluó la capacidad antitumoral de los péptidos oxitocina y desmopresina sobre una línea celular de cáncer mamario canino. De forma previa a la realización de los ensayos in vitro, se evaluó la presencia del receptor a oxitocina y vasopresina V2 en la línea celular CMT-U27 de cáncer mamario canino, ya que son los sitios de unión para ejercer su acción que utilizan la oxitocina y la desmopresina, respectivamente. Las células tumorales mostraron expresión para ambos receptores, lo cual demuestra que esta línea celular es óptima para evaluar el efecto de estos péptidos. En el ensayo in vitro se observó que la administración de oxitocina a dosis 1000 nM inhibió la proliferación de la línea CMT-U27, lo cual coincide con reportes previos en humanos, y permite sugerir que esta hormona ejerce efectos moduladores del crecimiento de las células tumorales. Por último, se demostró que la desmopresina (1000 nM) ejerció un efecto inhibidor del crecimiento de la línea celular CMT-U27. Por tanto, la observación de una alta expresión del ROT y RAVP V2 en los tumores mamarios caninos, sumado al efecto antiproliferativo que ejercieron la oxitocina y desmopresina en una línea celular de cáncer mamario canino, permiten recomendar que se considere a estos compuestos como una opción interesante para el tratamiento de los tumores mamarios caninos, y resulta de utilidad para continuar investigando péptidos análogos a ellos con mayor capacidad antiproliferativa.

Mammary gland tumors are the most frequent cancer described in female dogs, and the reported median age of occurrence ranges from 8 to 10 years. Ovarian steroid hormones, mainly estrogens and progesterone represent the main risk factor for the development of this neoplasm, and this idea is supported by the protective effect of ovariectomy. The presence of estrogen (ER) and progesterone receptors (PR) in canine mammary tumors has been described in several studies. Moreover, the expression of ER and PR is significantly higher in benign tumors compared with malignant ones. Nevertheless, information on the role of steroid hormone receptors and prognosis is inconsistent. Besides, some studies in humans have shown that apart from estrogens and progesterone, other hormones seem to be involved in the development and progression of mammary tumors. Thus, it has been demonstrated that the hormones oxytocin (OT) and vasopressin (AVP) are present in cancerous human breast tissue. Moreover, oxytocin receptor and V2 vasopressin receptor have been detected in primary breast carcinomas and in breast carcinoma cell lines. To the best of our knowledge, there are no studies regarding the expression of oxytocin receptor (OTR) and V2 vasopressin receptor (V2 AVPR) in canine mammary tumors. Surgical excision is the first-line treatment of canine mammary tumors. However, in dogs with highly malignant mammary tumors, the probability of tumor recurrence after surgery is elevated, so adjuvant therapy is recommended. Moreover, there are some patients in which surgery is not possible, so it is important to develop palliative therapies. Studies in human breast cancer cells have shown that OT and desmopressin (a synthetic analog of AVP) can modulate cell proliferation. The antitumor properties of both peptides have also been shown in experimental mouse models of breast cancer. In the bitch, the effects of these peptides on canine mammary cancer cell lines are not known. Thus, the main objective of the present thesis was to increase the knowledge of hormonal influences in the development of canine mammary tumors, by studying the presence of estrogens, progesterone, oxytocin and vasopressin receptors in canine mammary tumor tissues, and evaluating the effects of OT and desmopressin on cell proliferation using a canine mammary cancer cell line. In the first part of the present study, clinical and pathological features of 65 canine mammary tumors were evaluated. The results indicate that the mean age at which the mammary gland tumor was first recognized was 9.4 years. Regarding reproductive status, 76.9 % of the dogs were intact, giving further support to the idea that ovarian sexual steroid hormones are the main risk factor for the appearance of this neoplasm. Histology of the mammary gland tumors revealed that 60% of them were malignant, and 40% were benign. Among malignant tumors, tubulopapillary carcinomas were the most frequent tumor type, and among benign tumors, adenomas (simple and complex) were the most commonly diagnosed. Regarding immunohistochemical analysis, the present study showed that ERα expression was greater in benign than in malignant tumors. Furthermore, in the group of malignant tumors, a higher ERα expression was observed in tubulopapillary carcinomas and in Grade I tumors. These observations support the hypothesis that progression towards malignancy is accompanied by a decrease in hormonal steroid dependency, and suggest that ER expression is associated with clinicopathological characteristics of low malignant potential. Besides, in the present study ERβ expression was observed in both benign and malignant mammary tumors and no significant differences were found between them. In malignant tumors, no significant association was observed between ERβ expression and prognostic factors, so its significance could not be elucidated in the present thesis. Regarding PR expression, the present study also revealed that there was no significant difference in PR expression between benign and malignant tumors. However, in the group of malignant tumors, a higher PR expression was detected in clinical stages IV and V, suggesting that antiprogestins may be a useful therapy for bitches with advanced mammary cancer. Besides, in the second part of the present thesis it was demonstrated that OTR is present in both benign and malignant tumors. To the best of our knowledge, this is the first report regarding OTR expression in canine mammary tumors. In malignant tumors, OTR expression was higher in Grade I and II carcinomas, and showed a tendency to be higher in ERα positive tumors. Although further research is needed, the present results could indicate that OTR expression in malignant tumors is associated with good prognostic factors. In a similar way, immunohistochemistry revealed that all the analyzed mammary tumors expressed the V2 AVPR, with high Total Scores in both benign and malignant types. These findings represent the first report regarding V2 AVPR expression in canine mammary tumors, and suggest that desmopressin, a peptide with antitumor properties, could be an interesting option for the treatment of V2 AVPR expressing mammary tumors. Considering the need for new strategies for the treatment of canine mammary tumors, in the third part of the present thesis the antitumor effects of peptides oxytocin and desmopressin were investigated in vitro. In a preliminary study, the presence of OTR and V2 AVPR were demonstrated in the canine mammary cancer cell line CMT-U27, which indicates that this cell line is a useful in vitro model to evaluate the effects of these peptides. The in vitro assay revealed a growth inhibitory effect with OT at 1000 nM, which is in accordance with previous studies in humans, and suggests that this hormone has growth-modulatory effects in neoplastic mammary cells. Finally, desmopressin (1000 nM) induced a significantly inhibition of CMT-U27 proliferation. In conclusion, the results indicate that peptides oxytocin and desmopressin should be considered as promising compounds for the treatment of dogs with mammary tumors