Caracterización del mecanismo de acción de la proteína inductora de la defensa AsES y estudio de su efecto en la activación de la inmunidad antiviral en plantas

Abstract

Las plantas son constantemente desafiadas al ataque de patógenos. Para defenderse, cuentan con un sistema inmune innato, robusto y de amplio espectro que las protege contra la invasión de microbios. La primera línea de este sistema de defensa depende de la detección de inductores microbianos que inducen una cascada de respuestas que culminan restringiendo el avance del patógeno y evitando la enfermedad. AsES (Acremonium strictum Elicitor Subtilisin) es una proteína purificada a partir del sobrenadante de Acremonium strictum, capaz de inducir una respuesta de defensa en plantas de frutilla y Arabidopsis y generar protección frente a patógenos hemibiotróficos y necrótrofos como Colletotrichum acutatum y Botrytis cinerea respectivamente. A su vez, plantas de frutilla tratadas con AsES muestran la activación de una cascada de eventos intervinientes en la respuesta de defensa, por ej., influjo de calcio, estallido oxidativo, HR, refuerzo de la pared celular por deposición de callosa y lignina y acumulación de AS, sobreexpresión de genes de defensa, entre otros. El objetivo de la presente tesis doctoral consistió en la obtención de la proteína AsES de forma recombinante, en la determinación del requerimiento de la actividad enzimática en la inducción de la respuesta de defensa y en la profundización del mecanismo de acción por el cual AsES es percibida en la planta. Asimismo, se estudió el rol de la proteína AsES en la modulación de inmunidad antiviral en plantas. Los resultados obtenidos mostraron que la proteína AsES recombinante es capaz de inducir una respuesta de defensa similar a la de la proteína AsES nativa, obtenida a partir del sobrenadante del hongo A. strictum. La actividad enzimática no está implicada en la defensa, ya que tanto la proteína AsES recombinante inhibida en su actividad enzimática por el agregado de un inhibidor específico irreversible, como una versión mutante, inactivada enzimáticamente por mutagénesis sitio-dirigida, fueron capaces de inducir sobreexpresión de genes asociados a la defensa (PR1, WRKY70, ERF6) y proteger frente a B. cinerea en plantas de Arabidopsis. Además, péptidos individuales de diferentes epitopes de AsES no fueron capaces de reproducir estos resultados. La pérdida de protección frente a B. cinerea observada a todos los tiempos estudiados en una mutante knock-out para del co-receptor bak1.5 así como la inhibición en el crecimiento de plántulas de Arabidopsis y la sobreexpresión de genes indicadores de tipo PTI (PAMP-triggered immunity) sugieren que AsES se trata de un inductor de tipo PAMP, que es percibido por un receptor a nivel de membrana. Por otra parte, se observó una reducción marcada y significativa en la carga viral de plantas de Arabidopsis tratadas con AsES e infectadas con TMV-Cg. Resultados similares se observaron en plantas de Nicotiana tabacum en donde se evidenció además una reducción en el movimiento célula a célula y un retraso en el movimiento sistémico. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis contribuyen al conocimiento del mecanismo de acción de la proteína AsES y de su naturaleza. Además, el efecto de AsES en la activación de la inmunidad antiviral contribuirá al desarrollo de estrategias de manejo fitosanitario sostenible en diferentes cultivos de interés agronómico.

Plants are constantly threatened by pathogens. To defend themselves, they have an innate, robust and broad-spectrum immune system that protects them against the invasion of microbes. The first tier of this defense system depends on the detection of microbial elicitors that induce a cascade of responses that culminate restricting the pathogen and avoiding therefore the disease. AsES (Acremonium strictum Elicitor Subtilisin) is a protein purified from the supernatant of Acremonium strictum, capable of inducing a defense response in strawberry and Arabidopsis and generating protection against hemibiotrophic and necrotrophic pathogens such as Colletotrichum acutatum and Botrytis cinerea respectively. Also, strawberry plants treated with AsES showed a cascade of different events related to defense responses, such as calcium influx, oxidative burst, HR, cell wall reinforcement by callose and lignin deposition and accumulation of AS, overexpression of defense genes, etc. The aim of this work was to obtain AsES protein recombinantly, to determine the role of the enzymatic activity in the induction of the defense response and to deeply study the mechanism of action by which AsES is perceived. Likewise, the role of AsES in the modulation of the antiviral immunity in plants was also studied. Results showed that recombinant AsES protein was able to induce a defense response similar to what was previously observed for native AsES, obtained from A. strictum fungus supernatant. Enzyme activity is not involved in defense since both proteins, recombinant AsES inhibited in its enzymatic activity by the addition of a specific irreversible inhibitor, and a mutant version of it, enzymatically inactivated by site-directed mutagenesis, were able to induce overexpression of defense related genes (PR1, WRKY70, ERF6) and protect against B. cinerea in Arabidopsis. Individual peptides from different AsES epitopes were not able to reproduce these results. Loss of protection against B. cinerea in a knockout mutant for the co-receptor bak1.5 as well as seedling growth inhibition and the overexpression of PTI-marker genes (PAMP-triggered immunity); suggest that AsES is a PAMP-like elicitor, being perceived by a receptor at the membrane level. A significant reduction in the viral titer was also observed in Arabidopsis treated plants and infected with TMV-Cg. Similar results were observed in Nicotiana tabacum plants which also showed a reduction in cell to cell movement and a delay in systemic movement. The results obtained in this thesis contribute to the understanding of the mechanism of action of AsES and its nature. Also, AsES’ effect on the activation of plant antiviral immunity will allow the development of sustainable phytosanitary strategies in agronomical important crops.