Respuestas eco-fisiológicas de Daphnia frente a la radiación ultravioleta y variables ambientales

Abstract

Los grandes lagos del norte de la Patagonia Andina se caracterizan por ser muy profundos, ultraoligotróficos y albergar especies zooplanctónicas con estrategias para enfrentar a bajas calidades y cantidades de alimento y altas radiaciones de luz. Por otra parte, en la región también se pueden encontrar numerosos pequeños lagos someros con características diferentes; ya que poseen una mayor concentración de materia orgánica disuelta que disminuye la penetración de luz. A pesar de los contrastes entre estos ambientes, ambos son sensibles a los cambios climáticos globales vinculados a incrementos en la Radiación Ultravioleta (RUV); lo que produce que los organismos exhiban respuestas frente a estos cambios. El objetivo de esta Tesis fue analizar las estrategias fisiológicas que poseen dos especies planctónicas del género Daphnia (D. commutata y D. dadayana) frente a escenarios actuales y futuros de incremento en la RUV en interacción con otros factores. Estas dos especies habitan ambientes contrastantes, D. commutata es característica de lagos profundos y transparentes mientras que D. dadayana de lagos someros y con mayor concentración de materia orgánica disuelta. Una vez que llega a la superficie de la Tierra y a un cuerpo de agua, una parte de la luz solar penetra la columna de agua atenuándose a medida que llega a mayor profundidad. Además de la propia molécula de agua, la materia orgánica disuelta y la particulada son los factores que mayor efecto ejercen en la atenuación de la luz. En particular, las longitudes de onda que comprenden entre los 280 y 380 nm se caracterizan por su gran reactividad con el agua y con moléculas orgánicas generando subproductos reactivos de oxígeno (EROs, ?especies reactivas de oxígeno?) que causan daño celular afectando a los organismos. El estrés oxidativo resulta del desbalance entre la manifestación de EROs y la capacidad biológica del sistema de neutralizarlos. Para hacer frente a este estrés, los organismos pueden exhibir diferentes estrategias. Dentro de ellas pueden aumentar sus defensas, como por ejemplo las enzimas antioxidantes o los pigmentos fotoprotectores, con la finalidad de neutralizar la reactividad de las EROs y su potencial daño celular. Esta Tesis fue organizada en 6 capítulos. En el primero se presentan e introducen los conceptos teóricos a analizar a lo largo del trabajo, las hipótesis planteadas y los objetivos generales y específicos. En el segundo capítulo se analiza en Daphnia commutata el efecto de la RUV en la actividad de una enzima involucrada en el proceso de muda. En el tercer capítulo se analiza también en D. commutata, el efecto interactivo de la RUV con la calidad de alimento y la temperatura sobre una enzima antioxidante (Glutation S-Transferasa, GST) y otra encargada de hacer disponible un nutriente limitante como el fósforo (fosfatasa alcalina). En el cuarto capítulo se analiza la respuesta enzimática antioxidante de Daphnia dadayana frente a la exposición a RUV y se evalúa la importancia de la melanina como pigmento fotoprotector. En el quinto capítulo se analiza también en D. dadayana si la respuesta a la RUV se afecta por el desarrollo de estructuras anti-depredatorias (yelmo). Por último, en el sexto capítulo se incluyen las conclusiones finales de la Tesis.La quitobiasa (QB) es una enzima encargada de degradar la quitina del exosqueleto en artrópodos para que pueda desprenderse adecuadamente de la nueva cutícula en el momento de la muda. En ese momento el zooplancton se encuentra expuesto y vulnerable. Por esta razón, en el segundo capítulo se evaluó el efecto de la RUV en la enzima QB y el consecuente efecto en el proceso de muda de D. commutata. Para llevar a cabo esto, se expuso a neonatos de D. commutata de la misma cohorte a 2 h de RUV por día durante 8 días y se extrajeron ejemplares a diario para las determinaciones de la actividad de la QB. Los resultados obtenidos indicaron que la RUV produce una desincronización, tanto para la actividad de QB como para la sincronización de la cohorte para mudar. También se observó una disminución en el crecimiento de los individuos expuestos a RUV en particular a los cuatro días de exposición. Este efecto de la RUV en la sincronización de la muda se podría ver reflejado, no sólo en el crecimiento, sino también en la reproducción, ya que los neonatos tendrían dificultades para poder salir del nuevo caparazón.Mediante un experimento de laboratorio se analizó cómo D. commutata responde a la combinación de factores de estrés utilizando la actividad de la fosfatasa alcalina (AFA) como un proxy del requerimiento de fósforo y a la Glutation-S-Transferasa (GST) como un biomarcador del estrés oxidativo. Los experimentos de laboratorio consistieron en criar durante una semana individuos de D. commutata desde neonatos con tres calidades de alimento (baja, media y alta) y a dos temperaturas distintas (10 ºC y 20 ºC). El día siete fueron expuestos a RUV y luego medir la actividad enzimática antioxidante (GST) y la respuesta en la AFA. Se observó que la calidad del alimento afecta las respuestas frente a factores de estrés, como la RUV y la temperatura. Los resultados mostraron que cuando D. commutata se encuentra con baja calidad de alimento y a una temperatura de 20 ºC se ve limitada su actividad antioxidante. Bajo estas condiciones se registró una baja capacidad de respuesta frente al efecto de la radiación ultravioleta en comparación con el mismo tratamiento con media y buena calidad de alimento. Por otra parte, también disminuyó la capacidad de adquirir fósforo del alimento (AFA) y este efecto se vio incrementado aún más por la exposición a RUV. En cambio, a 10 ºC, hubo una clara respuesta al incrementar la AFA en las calidades de alimento baja y media en comparación con alta calidad. La calidad del alimento resultó un factor muy importante para los escenarios futuros donde según las predicciones del cambio climático podría aumentar la temperatura y la incidencia de RUV en los ambientes acuáticos.Los pigmentos fotoprotectores son la primera barrera contra el posible daño causado por la RUV. En la región se observaron individuos melánicos de Daphnia, por lo cual en el cuarto capítulo se planteó analizar la respuesta plástica de aumento de la concentración de melanina vs la actividad de antioxidantes frente a la exposición a RUV. Para ello se expusieron o no (tratamiento y control) individuos del cladócero melánico D. dadayana desde neonatos, a RUV por 2 horas todos los días, durante una semana. A través de fotografías laterales se midió la intensidad del pigmento del caparazón de D. dadayana día a día y al finalizar el experimento se midió la actividad de GST para determinar el nivel de estrés oxidativo de D. dadayana. Los resultados mostraron que hay un incremento de la concentración de melanina en el tiempo cuando D. dadayana está expuesta a RUV, indicando el carácter inducible de esta defensa. Por otro lado, la actividad de GST no presentó diferencias significativas entre control y tratamiento de RUV. Este resultado podría estar reflejando la efectividad de la melanina que sintetiza D. dadayana ya que no hubo diferencias en la actividad antioxidante por exposición a las dosis de RUV suministradas.Las defensas frente a la depredación intra-zooplanctónica significan una inversión de energía sobre todo cuando involucran estructuras morfológicas, siendo éstas inducidas por señales químicas (kairomonas) que los depredadores liberan al medio. Daphnia dadayana fue registrada en la región patagónica con formas con o sin yelmo. En el quinto capítulo se planteó analizar si la producción del yelmo afectaba a la respuesta frente a la RUV a través de la actividad de GST. Para llevar a cabo este objetivo se expusieron hembras con huevos partenogenéticos a señal química del copépodo depredador Parabroteas sarsi para inducir la defensa morfológica en forma de yelmo en los neonatos. En primer lugar, se logró verificar que la presencia de P. sarsi efectivamente induce la formación de yelmo, lo cual explicaría la existencia de los dos morfos de D. dadayana en la naturaleza. En presencia de P. sarsi, D. dadayana incrementó su tamaño en un 25% debido al yelmo. Sin embargo, el costo de producir esta defensa no reveló diferencias significativas en la respuesta de GST cuando es expuesta a RUV.Las conclusiones generales de esta Tesis indican que la RUV condiciona numerosas respuestas en las poblaciones de Daphnia de Patagonia Norte sobre todo en aquellas especies no melánicas como D. commutata. Estos cladóceros habitan lagos profundos y transparentes y con presencia de depredadores visuales (peces), por lo tanto, el melanismo no es una estrategia posible frente a la RUV. A pesar que para evitar la exposición a la RUV permanecen durante el día en regiones profundas afoticas durante la noche también quedan expuestas a EROS generadas por la RUV durante el día. Por lo tanto, las respuestas frente al estrés de esta especie resultan vitales para el mantenimiento de las redes tróficas lacustres. En tal sentido, la RUV afecta el crecimiento de esta especie a través de la desincronización de la muda y las respuestas antioxidantes se vieron afectadas también por la temperatura y la calidad de alimento. En contraposición, las especies melánicas que habitan lagunas someras (D. dadayana) parecen exhibir un bajo grado de estrés frente a la exposición directa de RUV. Además, las estrategias morfológicas frente a la depredación intra-zooplanctónica no afecta sus niveles de respuesta frente al estrés lumínico. Por último, las actividades enzimáticas resultan biomarcadores muy sensibles para visualizar efectos celulares en el zooplancton y son una herramienta muy eficaz a la hora de determinar efectos sub-letales como los generados por la RUV y otros factores ambientales como los estudiados en este trabajo.

North-Andean Patagonian large and deeplakes are ultra-oligotrophicsystems where zooplanktonic species develop different strategies to cope with low food quantity and quality and high exposure to Ultraviolet radiation (UVR). Additionally, the Patagonian region has many small and shallow lakes with high dissolved organic matter concentration and thus, low light penetration. However, both environments are sensitive to global climate change, particularly to increase in UVR that will affecttheir biota. The objective of this Thesis was to analyze the physiological responsesof two planktonic species of the genus Daphnia(D. commutataand D. dadayana) under present and future scenarios of increasingUVR, interacting with other factors.These two species inhabitcontrasting systems. D. commutatalives in deep and transparent lakes while D. dadayanainhabits small shallow lakes with high concentration of dissolved organic matter. When sunlight reaches the surface of aquatic systems, part of it is reflected and part penetrates the water. Once in the water column, the light is absorbed by the molecule of water and by the dissolved and particulate organic matter. In particular, shortwavelengths (280-380 nm) are characterized by its high reactivity with water and organic molecules, producing reactive oxygen species (ROS) that damage cells and affect the organisms. The oxidative stress results when the ambient ROS exceeds the biological capacity to neutralize them. Among the strategies to act against these ROS, organisms can increase different defense mechanisms, as photoprotective pigments, and antioxidant enzymes, in order to neutralize the ROS avoiding cell damage. This Thesis was organizedin sixchapters. The first one presents the main theoretical conceptsand topics of the study, thehypotheses,and thegeneral and specificobjectives.In the second chapter, we analyzed the effect of UVR on the enzymatic activityinvolved inthe molting process ofD. commutata.In the third chapter, we analyzed, inD. commutata, how two enzymatic systems (the antioxidant GST and the Alkaline Phosphate involve in P uptake) were affected by the interaction of UVR with food qualityand temperature. Inthe fourth chapter, the enzymatic antioxidant responseand the importance of melanin as a photo-protective pigmentis analyzedwhenD. dadayanais exposedtoUVR. Inthe fifth chapter, we determine if the develop of antipredator defenses (helmet) affects the response of D. dadayanato UVR. Finally,the lastchapter we include the general conclusions of the Thesis. During molting, the enzyme chitobiase (CB) is responsible forthe chitindegrading process,allowing the old shell tobe properly detached from the newone. In addition, in cladoceranmolting is synchronizedwith the detachment of parthenogenetic eggs. During this process,zooplankton is exposed and vulnerable to predation. Thus, in the second chapter, we analyzed UVR effect on the CB enzyme activity and the consequent effect on the molting process of D. commutata. We carried out an experiment in which Daphnianeonates from the samecohort grew for eight days with daily exposition of 2 h to UVR and a control (protected from UVR). Each dayof experimentation CB activitywas determined on individuals of each treatment. Results showeda decrease in the CB activity when Daphniawas exposedto UVR. In addition, a desynchronizationwas observedin the CB activity and inmolt synchronizationin the population. Consequently, a decrease in the growth of UVR exposed individuals was observedafter the fourth day of UVR exposure. UVR effect on moltsynchronization could imply a cost, not only in growthbut also in reproduction, sinceneonates would have difficulties to leave theold shell. In the next chapter, we analyzed how D. commutatarespondedto the combination of stress factors using the alkaline phosphatase activity (APA) as a proxy of the P requirement and Glutathione-S-Transferase (GST) as an oxidativestressbiomarker. Laboratory experiments were conducted withD. commutataneonates growing for a week fed withthree food qualities (low, medium and high) under two different temperatures (10 ºC and 20 ºC). On day seven, they were exposedto UVR and then antioxidant enzymatic activity (GST) and APAwere determined. It was observedthatfood qualityaffects responses to stress factors, such as UVR and temperature. The results showedthat when Daphniais underlow food quality at20ºC, its antioxidant activity is limited. Under these conditions,there wasa low response capacity against UVReffectcompared tothe sametemperature with medium and highfood quality. The ability to acquire P from the food (APA) also decreasedunder low food quality at 20 ºCandthis effect is further increased by UVR exposure.On the other hand,treatments at 10 ºCshowed an increase in APA underlow and medium food qualities compared to highquality. The food qualityrepresents animportant factor under future scenarios where, according toclimate changepredictions, temperature and UVRincidence in aquatic environments could increase. Photo-protective pigments are the first barrier against UVR damage. In Patagonia Daphnia dadayanawas observed with melanic individuals. We analyzedtheplastic response ofincreasing melanin concentration in this species and theantioxidantactivity when exposed to UVR. We carried out an experiment where neonates of D. dadayanawere exposedto UVRfor 2 hours every day, duringa weekwith a control protected from short wavelength radiation.Pigment intensity in Daphniacarapace was measureddaily through lateral images.Atthe end of the experiment, GST activity was measuredto determine oxidative stress. The results showed that there wasan increase in melanin concentration over time. On the other hand, GST activity did notshowsignificant differences between control and UVR treatment. This result could enlighten the melanine ffectiveness of D. dadayana carapace, as there wasno measurable response in antioxidant activity when individuals were exposedto UVR. Intra-zooplanktonicpredation defenses aremorphological structuresinducible by chemical signals (kairomones) releasedby predators inthe aquatic environment. These defenses involveanenergycost that hasbeen relatedto a decrease in reproduction. In this chapter,we analyzed if this cost also affectsantioxidant responses.D. dadayanawas recordedwith or without a helmet, thus weevaluated the helmet production cost, through the GST activitywhen D. dadayanawith and without helmet is exposed to UVR. The predatory copepod Parabroteas sarsiwas used toinduce helmet production in neonates. In fact, kairomones releaseby P. sarsieffectively inducedhelmetformationin neonates, which would explain the existence of the twoD. dadayanamorphs in nature. Neonates with and without helmet were exposedto UVRor protected for 3 days in a factorial design. Results showedthat D. dadayanawith and without helmet did not showdifferences in the antioxidant response when exposed to UVR. Thus, this inducible defense did not affect the antioxidant response. In summary, in this work we conclude that UVR is important for several population responses of Daphniain North Patagonia. In particular, the non-melanic species D.commutataresulted more vulnerable to UVR. Unpigmented Daphnia commutatalives in transparent lakes with fish, thus melanism is not a suitable strategy against UVR. Although this species develops dial vertical migration to avoid predation and UVR during day, during night individuals move upwards and are exposed to remaining ROS generated by UVR. UVR interacts with other factors as temperature and food quality affecting the capacity of P assimilation. In addition, UVR may have important effect in the molting process through the negative effect on the enzyme chitobiase. Therefore, UVRresponse in this species would be of particular importance for the maintenance of the lacustrine trophic food web. On the other hand, the melanic species D. dadayana, inhabits shallow and fishless lakes. This species showed low antioxidant response to UVR due to the accumulation of the photoprotective pigmentmelaninduring UVR exposure. Finally, the presence of helmet, aninducible antipredator morphological defense, seems not affectthe enzymatic response to UVR. To conclude, enzymatic activities are sensitivebiomarkers to determine differenteffect at the cellular level in zooplankton and this approach resulted in a very good tool for analyze sublethal effectsas those of UVR.