Identificación molecular de subtipos de Escherichia coli verotoxigénico O157:H7 asociados a patogenicidad y a virulencia

Abstract

Escherichia coli verotoxigénico (VTEC) representa un grupo muy importante de patógenos emergentes, causante de diarrea y severas enfermedades en seres humanos, tales como colitis hemorrágica o síndrome urémico hemolítico (SUH). El SUH afecta mayormente a niños menores de 5 años, es la principal causa de insuficiencia renal aguda, una de las más importantes de insuficiencia renal crónica y puede causar la muerte. El bovino es el principal reservorio y los alimentos contaminados, la principal vía de contagio al hombre. Argentina posee la mayor incidencia a nivel mundial de SUH y una alta prevalencia de VTEC en bovinos y alimentos derivados. El serotipo O157:H7 es el mayormente involucrado en los casos de enfermedad en el mundo, y en Argentina, también el más frecuentemente asociado al SUH. Sin embargo, no todos los aislamientos de O157:H7 tienen la misma capacidad de infectar y de causar enfermedad en el hombre. Estudios filogenéticos determinaron que las cepas O157:H7 integran subpoblaciones de dispersión mundial, las cuales diferirían en relación a su asociación con enfermedad. A partir del análisis comparativo de genomas, se han descripto varios métodos de subtipificación molecular, los cuales analizan distintas regiones y tipos de variación en el genoma. La combinación de los datos obtenidos por esta variedad de metodologías puede ofrecer una visión más amplia y robusta sobre la estructura poblacional y la virulencia de este serotipo. En este contexto se plantearon como objetivos conocer la diversidad genética de VTEC O157:H7 de Argentina, en particular de aquellas cepas que están circulando en la región pampeana, e identificar subtipos asociados a patogenicidad y virulencia. Para ello, se usaron distintos métodos de subtipificación molecular, tales como polimorfismos específicos de linaje (LSPA6), polimorfismos de nucleótido simple (SNP) (rhsA 3468 C>G y tir 255 T>A), análisis de múltiples loci VNTR (MLVA), y determinación de filogrupos. Por otro lado se analizó la presencia de genes relacionados con virulencia, tales como genes que codifican factores putativos de virulencia (FPV), genes codificados en plásmidos, de genes que codifican efectores no codificados en LEE (nle), presentes en islas de patogenicidad y genes que codifican factores de adherencia. Como complemento, se evaluó también, la actividad citotóxica de los aislamientos. El 98 % de ellos pertenecieron al linaje I/II (2 % al linaje II). El 100 % presentó el alelo del SNP (8_rhsA) correspondiente al clado 8. Un alto porcentaje de aislamientos presentó en alelo tir 255 T>A T, asociado a hipervirulencia, y fue asignado al filogrupo E. Según el MLVA se encontró una amplia diversidad genética. Todos los aislamientos mostraron el perfil plasmídico ehxA-espPkatP-stcE y poseyeron los genes ehaA, elfA, iha y lpfA variantes lpfA1-3, lpfA2-2 y ECSP_0242. Las frecuencias de los genes ECSP fueron 95 % ECSP_2687, 88 % ECSP_3286, 86 %ECSP_3620, 53 % ECSP_2870/2872 y 44 % ECSP_1733. Los aislamientos se agruparon en once perfiles nle, el 46 % fueron positivos para todos los genes nle, mientras que los aislamientos restantes, excepto dos, carecieron de nleF mostrando la OI-71 incompleta. Todas las cepas O157:H7, excepto el aislamiento identificado como linaje II, fueron citotóxicas en células Vero. Los resultados indican que las cepas de la región pampeana de Argentina son un grupo filogenéticamente homogéneo que presenta diversidad genética en relación a sus perfiles MLVA y de genes nle. La pertenencia de los aislamientos al clado hipervirulento 8 y al linaje I/II, la alta prevalencia del alelo tir 255 T>A T y de genes de factores putativos de virulencia, permite asignar a la mayoría de las cepas O157:H7 de esta región un alto riesgo para la salud pública.

Verotoxin-producing E. coli (VTEC) O157:H7 is the dominant serotype isolated from patients with HUS and, Argentine has the highest rate of HUS in the world. However, not all O157:H7 isolates have the same ability to infect and cause disease in humans. Molecular typing had allowed to identify subpopulations related to the origin and virulence of O157:H7 strains. Our aim was to perform a genetic characterization of 43 O157:H7 strains isolated in Argentine mostly from cattle and humans in order to establish the potential public health risk. For this purpose, a combination of molecular subtyping methods were used, lineage-specific polymorphisms (LSPA6), simple nucleotide polymorphisms (SNP) (rhsA 3468 C>G y tir 255 T>A), multiple loci VNTR analysis (MLVA) and phylotyping determination; on the other hand, analysis of genes related to virulence, such as genes encoding putative virulence determinants (FPV), factors codified in plasmids, effectors not codified in LEE (nle) and genes encoding adherence determinants. Also, the cytotoxicity activity of the isolates was evaluated. The 98 % of them belonged to lineage I/II (2 % lineage II). All isolates carried the clade 8 SNP variant (8_rhsA). A high percentage of isolates presented tir allele 255 T>A T, associated with hypervirulence, and was assigned to phylogroup E. According to MLVA, a wide genetic diversity was found. All isolates showed the plasmid profile ehxA-espP-katP-stcE and harbored ehaA, elfA, iha and lpfA variants lpfA1-3 and lpfA2-2 and, ECSP_0242. The frequencies of the remaining ECSP genes were 95 % ECSP_2687, 88 % ECSP_3286, 86 % ECSP_3620, 53 % ECSP_2870/2872 and 44 % ECSP_1733. Isolates were grouped into eleven nle profiles, 46 % were positive for all nle genes, while the remaining isolates, except two, showed incomplete OI71, particularly lacked nleF. All O157:H7 strains, except the isolate identified as lineage II, were cytotoxic on Vero cells. Results point out that argentinean pampa region strains are a phylogenetically homogenous group, which shows genetic diversity in MLVA and nle profiles. The belonging of the isolates to hypervirulent clade 8 and lineage I/II, the high prevalence of the allele tir 255 T>A T and nle and putative virulence factors genes, would allow assigning most O157:H7 strains of this region a high risk to public health.