Mecanismo anti-inflamatorio de la nitrona 5,5-DIMETIL-1-PIRROLINA N-OXIDO: énfasis en la inflamación del tejido adiposo obeso

Abstract

La obesidad es una enfermedad inflamatoria crónica de bajo grado en la cual el tejido adiposo se encuentra metabólicamente estresado por un aumento en las especies reactivas del oxígeno, ácidos grasos libres, hipoxia e infiltración de macrófagos pro-inflamatorios. Estudios preliminares indican que el espin trap de tipo nitrona 5,5-dimetil-1-pirrolina N-óxido (DMPO) tiene efectos anti-inflamatorios en células RAW 264.7 inducidas por LPS, pero los mecanismos por los cuales DMPO ejerce sus efectos permanecen desconocidos. En base a esto propusimos que DMPO posee efectos a largo plazo en el transcriptoma de macrófagos que previenen el cambio fenotípico pro-inflamatorio producido por LPS y efectos a corto plazo relacionados a la interferencia en el señalamiento del receptor de LPS, TLR-4. Para poner a prueba la hipótesis se realizó un estudio transcriptómico utilizando la tecnología de microarreglos junto a herramientas bioinformáticas y genómica funcional en modelos experimentales in vitro, in silico e in vivo. Los resultados obtenidos indicaron que DMPO por sí solo posee efectos en el transcriptoma de macrófagos relacionados a la regulación negativa del sistema inmune actuando sobre diferentes receptores TLRs y factores de transcripción IRFs. Por otro lado, el espin trap tuvo efectos inhibidores de la transcripción en 161 genes relacionados a la respuesta inflamatoria y al sistema inmune en células estimuladas con LPS. Los cambios observados fueron confirmados utilizando tecnología nCounter, técnicas de ELISA y western-blot. Luego, determinamos la interacción de DMPO con el dominio TIR del receptor TLR utilizando simulaciones in silico, a partir de las cuales se determinó que DMPO interaccionaría con la región BB-loop responsable de la transducción de la señala indicando un posible mecanismos del efecto anti-inflamatorio. Por último, por medio de la utilización de un modelo animal de ratones con síndrome metabólico instilados con LPS se determinó que los efectos anti-inflamatorios de DMPO son extrapolables al modelo in vivo. En la presente tesis se determinaron posibles mecanismos por los cuales la nitrona DMPO inhibe la activación inflamatoria de los macrófagos por LPS, haciendo un gran aporte para la utilización de derivados de espin-traps como una plataforma estructural en el diseño de nuevos fármacos anti-inflamatorios basados en su mecanismo de acción.

Obesity is a chronic low-grade inflammatory diseases, in which adipose tissue is metabolically stressed by hypoxia, free fatty acids, reactive oxygen species and pro-inflammatory macrophages infiltration. Preliminary studies have shown that nitrone spin trap 5,5-dimethyl1-pyrroline N-oxide (DMPO) possess anti-inflammatory effects in a model of lipopolysaccharide (LPS)-primed RAW 264.7 cell line, however the mechanisms by which DMPO exerts its effects remain unknown. Taking this into account we propose that DMPO has long-term effects on macrophage transcriptome that prevents macrophage switch towards an inflammatory phenotype induced by LPS; and also short-term effects related to interference of TLR signaling pathways in early stages of LPS-induced activation. To test this hypothesis we performed a transcriptomic analysis using microarray technology together with bioinformatics tools and functional genomics in 3 different experimental models: in vitro, in silico and in vivo. Results obtained indicated that DMPO by itself has effects related to negative regulation of immune system on the transcriptome of macrophages by acting upon several TLRs receptors and IRFs transcription factors. Moreover, DMPO was able to inhibit 161 genes related to immune system and inflammatory response in the transcriptome of LPSprimed macrophages, these changes were confirmed using nCounter technology, ELISA and western-blot techniques. Later we performed docking simulations to determine the interaction between DMPO and TLR´s TIR domain. Results showed that DMPO binds to a region necessary for signal transduction called BB-loop, which would interfere TLR signaling thus explaining DMPO short- term anti-inflammatory effects. Finally, we used an experimental inflammatory model of mice with metabolic syndrome instilated with LPS to test the effects of DMPO in vivo, results showed that the spin trap was able to reduce inflammation markers on serum and adipose tissue demonstrating that anti-inflammatory effects of DMPO can be extrapolated to in vivo models. Herein, we determined some of the possible mechanisms by which the nitrone spin trap DMPO inhibits LPS-induced inflammatory activation in macrophages, making of this information a significant contribution to the development of nitrone-based anti-inflammatory drugs.