Producción de Vitamina B12 por Lactobacilos: estudios moleculares y funcionales

Abstract

La vitamina B12 o cobalamina es un metabolito esencial en los seres humanos debido a que interviene en dos reacciones celulares fundamentales, una de ellas es la síntesis del aminoácido metionina a partir de la homocisteína (síntesis de ADN) y la otra es la conversión del metilmalonil-CoA en succinil-CoA (utilización de propionil-CoA para formar ATP). La cobalamina es sintetizada exclusivamente por algunas cepas bacterianas y arqueas. Si bien, algunas cepas de bacterias productoras de vitamina se encuentran en el rumen del ganado vacuno, ovino y caprino, no forman parte de la microbiota intestinal del hombre y otros animales. Por este motivo, estos últimos están obligados a incorporar cobalamina a través de alimentos de origen animal o productos farmacéuticos. En este contexto, la carencia en vitamina B12 puede desarrollarse como consecuencia de dietas vegetarianas estrictas y/o malnutrición, y se encuentra acentuada en el embarazo, la lactancia, la ancianidad y la niñez. El género Lactobacillus se presenta, dentro del grupo de Bacterias Lácticas, como productor de nutracéuticos debido a la capacidad de sintetizar metabolitos esenciales tales como vitamina B12. En esta Tesis Doctoral, se estudiaron a niveles genómico y bioquímico dos cepas del género Lactobacillus productoras de vitamina B12, con el fin de caracterizar las vías de producción de cada cepa y determinar así las condiciones óptimas de producción de dicha macromolécula. Paralelamente, se realizaron estudios in silico a partir de genomas depositados en la base de datos que permitieron la búsqueda de genes que codifican para proteínas necesarias para la síntesis de vitamina B12 en otras cepas del género aisladas de diferentes nichos ecológicos. Por último, se comprobó la biodisponibilidad del metabolito producido en un sustrato alimenticio de origen vegetal como el extracto acuoso de soja mediante un modelo experimental de avitaminosis nutricional en ratones hembras y su progenie. En este trabajo de tesis se demostró por primera vez que Lactobacillus reuteri CRL 1098 y Lactobacillus coryniformis CRL 1001 poseen diferencias genéticas puntuales que llevan a rutas biosintéticas diferentes para los últimos pasos de ensamblaje de la vitamina, siendo la vía más comúnmente hallada la de la cepa CRL 1001. Los estudios bioquímicos mostraron una mayor producción de vitamina con el agregado de cobalto y 5,6-dimetilbencimidazol al medio de cultivo para ambas cepas, siendo mayor la producción con el agregado de L-treonina sólo para la cepa CRL 1001. Los estudios in vivo demostraron que la cepa CRL 1001 crecida en extracto acuoso de soja fue capaz de revertir el déficit de vitamina B12 en la dieta de ratones hembras y sus crías. Los estudios realizados en este trabajo de tesis sientan las bases bioquímicas, fisiológicas y funcionales de la producción de vitamina B12 por cepas lácticas con el fin de desarrollar en un futuro una etapa de investigación aplicada tendiente a obtener un paquete tecnológico exitoso.

Vitamin B12 or cobalamin is an essential metabolite in humans because it participates in two fundamental cellular reactions, the synthesis of methionine from homocysteine (DNA synthesis) and the conversion of methylmalonyl-CoA in succinyl-CoA (propionyl-CoA utilization to obtaining ATP). Cobalamin is exclusively synthesized by some bacterial and archaea strains. Although some vitamin-producing bacteria are found in the rumen of cattle, sheep and goats, they are not in the intestinal microbiota of human and other animals. For this reason, humans must incorporate cobalamin from foods of animal origin or pharmaceutical products. In this context, the strict vegetarian diets and/or malnutrition can cause a vitamin B12 deficiency, and this could be intensified in case of pregnancy, lactation, old age and childhood. The Lactobacillus genus is presented, within the group of Lactic Acid Bacteria, as a nutraceuticals producer due to the ability to synthesize essential metabolites such as vitamin B12. In this Doctoral Thesis, we studied two Lactobacillus strains vitamin B12 producers at genomic and biochemical levels to characterize the production routes of each strain and determine the optimal production conditions of this macromolecule. In addition, we carried out in silico studies of genomes deposited in the database searching genes that encode proteins necessary for the vitamin B12 biosynthesis in other Lactobacillus strains isolated from different ecological niches. Finally, the bioavailability of the produced metabolite in a food substrate of vegetable origin, as the soybean aqueous extract, was proved by an experimental mice model of nutritional vitamin deficiency. In this thesis work, for the first time it was demonstrated that Lactobacillus reuteri CRL 1098 and Lactobacillus coryniformis CRL 1001 have specific genetic differences that lead to different biosynthetic pathways, being the most commonly known route found in the CRL 1001 strain. The biochemical studies showed a higher vitamin production of both strains with the addition of intermediaries, as cobalt and 5,6- dimethylbenzimidazole, to the culture medium. However, the addition of L-threonine to the culture medium improved only the CRL 1001 vitamin production. In vivo studies showed that the CRL 1001 strain grown in soybean aqueous extract was able to revert the vitamin B12 deficiency diet in female mice and their progeny. The studies carried out in this doctoral thesis established the biochemical, physiological and functional bases of vitamin B12 production by lactic acid bacteria strains to develop in the future stage an applied research aimed to obtain a successful technological product.