Estudio de disruptores del metabolismo de prolina como nuevos agentes tripanocidas

Abstract

La enfermedad de Chagas es transmitida por el parásito Trypanosoma cruzi, el cual posee un ciclo de vida complejo que alterna entre hospedador invertebrado y vertebrado.La prolina participa en la diferenciación de epimastigotes intracelulares al estadio tripomastigote, que es la forma necesaria para el establecimiento de la infección en el hospedador mamífero. Ha sido reportado, que L-prolina es importada desde el entorno extracelular por medio de dos transportadores activos, convirtiéndose en cinco intermedios del ciclo de Krebs, que son rápidamente metabolizados.Con el objetivo de utilizar el transporte de prolina como blanco para el desarrollo de nuevos fármacos, diseñamos y sintetizamos una serie de derivados de este aminoácido. Estos compuestos poseen el aminoácido esterificado, un anillo 1,2,3-triazol, que actúa de espaciador inerte (linker), que posee unidos distintos sustituyentes cubriendo un amplio rango de demanda estérica y libertad conformacional. Además, se sintetizó otra serie de análogos, alquilados directamente sobre el aminoácido esterificado, también cubriendo diversidad de sustituyentes.Se determinó la actividad antiparasitaria de las dos colecciones de compuestos preparados en epimastigotes de Trypanosoma cruzi. Los compuestos más activos tienen IC50 entre 49 y 25 M, teniendo cadenas alifáticas o isoprénicas de más de 10 átomos de carbono unidas al 1,2,3-triazol. Los 4 derivados más activos se seleccionaron y fueron ensayados en el resto de las 5 DTUs, mostrando diferencias en el orden de actividad en las DTUs y sensibilidad variable entre éstas últimas. Sin embargo, estas diferencias no fueron significativas. Adicionalmente, se estudió el mecanismo de muerte celular por citometría de flujo, arrojando resultados que indicarían un mecanismo de apoptosis tardía-necrosis para el derivado ITP-I-G (R=E-farnesilo) cuando fue ensayado a su IC80 quedando indefinido para el resto de los derivados.Continuando el trabajo con los 4 derivados seleccionados, se buscó validar el mecanismo de acción estudiando la incorporación de L-prolina. Los estudios de internalización mostraron que los derivados ITP-I-G e ITP-I-B (R=decilo), inhiben de manera significativa la internalización de prolina. Posteriormente, se logró demostrar que estos mismo dos compuestos son capaces de inhibir el transportador en ensayos comparando la sensibilidad en el ensayo de actividad antiproliferativa entre la cepa TcGFP y Tc069, que sobreexpresa el transportador TcAAAP069.Utilizando un derivado fluorescente de ITP-I-B, se estudió su internalización en los diferentes estadios del parásito, siendo incorporado en todos ellos. En el ensayo con amastigotes se obtuvo un resultado sorprendente, se observó que el derivado fluorescente se concentraba dentro del parásito intracelular, con baja o nula señal en las células infectadas. Contrariamente, los ensayos con el derivado control que no posee prolina, mostraron una distribución homogénea entre todas las células.Para estudiar los metabolitos excretados por T. cruzi, se realizaron ensayos con RMN encontrando que sólo cuando los parásitos son tratados con ITP-I-G, no se altera el perfil metabólico en ensayos con medio rico en glucosa.Conforme a los resultados obtenidos, este trabajo de tesis es un puntapié inicial a la validación de blancos moleculares mediante el diseño y síntesis de análogos de moléculas. Además, con los promisorios resultados obtenidos entre ellos, la incorporación de un análogo fluorescente sintetizado, en todos los estadios de T. cruzi, especialmente en amastigotes, donde se observó casi toda la señal fluorescente en el interior del parásito, interfiriendo en el transporte de prolina, internalizándose debido a su cadena de sustituyente lineal. Esto abre las puertas a muchos interrogantes que serán respondidos, con análogos fluorescentes a sintetizar, como por ejemplo un análogo de ITP-I-G, el cual bloquearía el transportador debido a su conformación química anidada, y esto se vería reflejado en señal fluorescente en la membrana parasitaria.