Desarrollo de sistemas de diagnóstico para la hormona estimulante de tiroides (TSH) en suero humano: ELISA e Inmuno-PCR cuantitativa (qIPCR)

Abstract

La función de la glándula tiroides está regulada por la hormona estimulante de la tiroides (TSH), una hormona glicoproteica secretada por la hipófisis anterior. En respuesta principalmente a TRH, la TSH madura se libera a la circulación e induce la síntesis y secreción de las hormonas tiroideas: triyodotironina (T3) y tiroxina (T4), que son las hormonas metabólicamente activas. La secreción de TSH está regulada por TRH y por un ciclo de retroalimentación negativa en el que las hormonas T3 y T4 actúan a nivel pituitario e hipotalámico. Dado que el control por retroalimentación de la secreción de TSH es exquisitamente sensible a las hormonas tiroideas periféricas, la mayoría de los trastornos tiroideos pueden diagnosticarse midiendo los niveles de TSH y de las hormonas tiroideas. Por esta razón, para la toma de decisiones clínicas, la medición de TSH en suero humano ha sido establecida como la "primera línea" para el diagnóstico de la función tiroidea. La mayoría de los métodos actuales para la determinación de TSH utilizados en los laboratorios clínicos son inmunoensayos heterogéneos "sandwich" que implican (1) enzimas, (2) sustratos fluorométricos o (3) marcadores quimioluminiscentes. En comparación con los inmunoensayos competitivos tradicionales, como los radioinmunoensayos, los inmunoensayos heterogéneos para cuantificar TSH ofrecen (1) límites de detección más bajos, (2) tiempo de respuesta rápido y (3) un rango de medición lineal más amplio. En virtud de su obvia importancia para el diagnóstico clínico, se ha realizado un esfuerzo constante para desarrollar métodos analíticos con alta sensibilidad para TSH en fluidos corporales humanos. Aunque la sensibilidad y la reproducibilidad de los inmunoensayos de TSH han ido mejorando progresivamente en los últimos 30 años, existen discrepancias analíticas en las determinaciones cuantitativas de TSH entre los sistemas disponibles comercialmente. La mayor variabilidad entre métodos se encuentra a bajas concentraciones de la hormona (por debajo de 0,4 μUI/ml), debido a la menor capacidad de detección y a la sensibilidad analítica de los inmunoensayos en este rango de concentraciones. En 1992, Sano y col. crearon una técnica llamada inmuno-PCR (IPCR), en la que reemplazaron la enzima de detección del ELISA por una sonda de ADN conjugada a biotina. Esta sonda de ADN luego es amplificada mediante PCR para la generación de señal, siendo el número de amplicones producidos proporcionales a la cantidad antígeno detectado. Desde la aparición de esta técnica, diversas aplicaciones y estrategias de IPCR se han desarrollado para la detección de innumerables antígenos. A lo largo de los años, estos estudios han demostrado que un ensayo de IPCR puede mejorar el límite de detección de 10 a 10.000 veces más que el de un ensayo de ELISA homólogo.En este trabajo de tesis desarrollamos un ensayo de ELISA sandwich y uno de IPCR altamente sensible, específicos para la detección de la hormona estimulante de la tiroides humana (hTSH). Se generó un panel de anticuerpos monoclonales (MAbs) contra hTSH por tecnología de hibridomas y se seleccionaron racionalmente combinaciones de anticuerpos. Se establecieron las condiciones de ensayo óptimas para la determinación de la hormona por ELISA sandwich y se seleccionaron dos pares de MAbs (B-4 y B-9). Estos prototipos de ELISA se evaluaron frente a patrones calibrados con la 2ª preparación internacional de referencia de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y en comparación con un kit ELISA comercial. Aunque el límite de detección (LD) fue de 0,1 μUI/ml en todos los casos, el prototipo de ELISA B-9 mostró un rendimiento analítico similar al kit de ELISA comercial. Por lo tanto, seleccionamos B-9 para desarrollar el ensayo de IPCR sandwich específico, utilizando el formato "Universal", en tubos de PCR estándar sin pretratamiento. La amplificación de la señal se logró a través de la interacción entre el MAb de detección biotinilado y la sonda de ADN mono-biotinilada, previamente autoensamblada con neutravidina. En comparación con los ELISAs evaluados, el ensayo de IPCR mostró un menor LD y un considerable aumento de la sensibilidad (pendiente), proporcionando una mejor resolución cuantitativa en el rango de bajas concentraciones de la hormona. La sensibilidad, facilidad de uso y el bajo costo de la técnica IPCR desarrollada ubican a esta metodología como una plataforma potencial para la detección cuantitativa de hTSH en muestras de suero humano. Además, el método de IPCR descripto (universal) demostró ser un formato práctico y versátil, realizado en tubos de PCR estándar. Nuestros resultados respaldan el potencial de la técnica para su aplicación en el diagnóstico de los estados tiroideos y para la medición confiable de niveles bajos clínicamente relevantes. Consideramos que el método propuesto puede posicionarse como alternativa metodológica para el análisis de hormonas.