Determinación sexual y diferenciación gonadal en Yacaré overo. Genes involucrados en su regulación y efecto de la exposición a perturbadores endocrinos

Abstract

El conocimiento sobre las bases moleculares y fisiológicas que determinan el sexo en los reptiles es aún incompleto. La determinación sexual es el proceso que guía a las gónadas bipotenciales (indiferenciadas) a desarrollarse en testículos u ovarios. Puede iniciarse mediante la activación de un gen específico (en especies con determinación sexual genética -pura- DSG) o la influencia del ambiente (en especies con determinación sexual termo-dependiente -DST-por ejemplo) o puede tener elementos de ambos. La diferenciación gonadal se refiere al desarrollo de órganos sexuales especializados (testículos u ovarios).El sexo de las crías de todas las especies de cocodrílidos y muchas especies de tortugas está determinado por el medio ambiente. La temperatura de incubación de los huevos durante un período crítico de desarrollo (período termosensible-PTS-) es el principal factor que determina el sexo en ausencia de cromosomas sexuales.A su vez, en los vertebrados en general, los estrógenos son esenciales para el desarrollo ovárico. Los estrógenos pueden anular la temperatura e inducir la diferenciación ovárica incluso a temperaturas de masculinización. La administración de 17β-estradiol durante el PTS anula los efectos de la temperatura productora de machos, produciendo hembras fenotípicas en Trachemys scripta, tortuga de orejas rojas, (Thunberg in Schoepff, 1792) y Alligator mississippiensis, aligátor americano, (Daudin, 1802), entre otros. Este efecto se ha definido como determinación del sexo inducida por estrógenos (DSE2).Caiman latirostris, yacaré overo (Daudin, 1802), es una de las dos especies de cocodrílidos que habitan en Argentina. Es un reptil con DST; como ya se ha mencionado, huevos incubados a 30-31°C produce el 100% de crías hembras, y la incubación a 33-34 ° C produce solo machos. Quedan definidas así la temperatura productora de hembras (TPH: 30°C) y la de machos (TPM: 33°C).En general, se acepta que la temperatura inicia una cascada de eventos moleculares que favorecen el desarrollo de un sexo u otro, alterando el control de la expresión génica y la señalización celular de hormonas esteroides, receptores hormonales y enzimas esteroidogénicas. Numerosos genes termo-sensibles están implicados en la diferenciación gonadal en especies con DST: amh, sox-9, sf-1 y el gen que codifica para aromatasa (cyp19-a1), entre otros. En algunas especies de tortugas con DST, la actividad de la aromatasa es más alta en gónadas provenientes de huevos incubados a TPH. A sí mismo, los estrógenos son capaces de modificar la expresión de diferentes genes como ya se ha visto en peces, tortugas y cocodrílidos, entre ellos, nuestro grupo de trabajo ha demostrado que la expresión de sox-9 se ve alterada en hembras de C. latirostris, en etapa postnatal, cuya determinación sexual fue inducida por estrógenos. Se conoce, que numerosos contaminantes presentes en el ambiente, comúnmente denominados químicos perturbadores endocrinos (PEs), poseen la potencialidad de alterar la homeostasis del sistema endocrino afectando la salud, la reproducción y el comportamiento de animales y humanos y de sus progenies.La atrazina es un herbicida ampliamente usado a nivel mundial, que ejerce su acción a través de la inhibición de la fotosíntesis. Posee probada actividad de PE en diferentes especies y su principal efecto se asocia a su capacidad desmasculinizante de las gónadas en peces teleósteos, anfibios, reptiles y mamíferos. Se habla de "desmasculinización" de las gónadas masculinas como una disminución en las características gonadales masculinas, que incluyen disminuciones en el tamaño testicular, disminución en el número de células de Sertoli, disminución en la producción de espermatozoides y disminución en la producción de andrógenos.Dados estos antecedentes, nos propusimos profundizar en el conocimiento respecto a la biología del desarrollo y fisiología del sistema reproductor del yacaré overo, investigar las complejas interacciones entre genes y ambiente y establecer nuevas vías de acción de PEs, analizando consecuencias de la exposición prenatal a contaminantes PEs de origen industrial y aplicación agrícola a nivel molecular, celular, tisular y orgánico. Para ello, huevos de C.latirostris fueron recolectados poco después de la oviposición (previo al PTS), de una región ubicada en un área protegida (Reserva Natural ?El Cachapé?) en la provincia de Chaco, Argentina. Esta región, se caracteriza por una baja a moderada intervención antrópica. Los huevos fueron transportados al laboratorio e incubados a una temperatura constante de 30ºC (TPH) ó a una temperatura constante de 33ºC (TPM).Para definir la etapa de desarrollo de los embriones de C. latirostris se siguieron criterios ya establecidos y al momento en que los embriones mostraran las características propias del estadio 20 de desarrollo embrionario, se aplicaron los tratamientos tópicamente sobre la cáscara del huevo, en una única dosis, antes del PTS. Quedando establecidos los diferentes grupos experimentales. A los 30ºC (temperatura de producción de hembras- TPH) los huevos recibieron vehículo (50 μl de etanol absoluto), con el fin de estudiar las gónadas embrionarias femeninas obtenidas por temperatura (hembras-DST). A los 33ºC (temperatura de producción de machos-TPM), los huevos recibieron diferentes tratamientos: por un lado, recibieron vehículo (50 μl de etanol absoluto), con el fin de estudiar las gónadas de embriones machos obtenidas por temperatura (machos-DST). Otro grupo recibió una dosis de 1,4 ppm de 17β-estradiol, para estudiar las gónadas de hembras obtenidas por acción de los estrógenos (hembras-DSE2) y el último grupo lo formaron huevos incubados a TPM topicados con una dosis ambientalmente relevante (0,2 ppm) de Atrazina (ATZ), con el fin de evaluar la acción de este compuesto considerado como un potencial PE (Machos-DST-ATZ). Se seleccionaron tres estadios de desarrollo embrionario para el estudio: estadio 22 (E22), correspondiente al inicio del PTS, estadio 24 (E24) hacia el final de PTS y estadio 27 (E27) hacia el final del desarrollo embrionario. En cada estadio, se obtuvieron las muestras de complejo GAM (Gónada-Adrenal-Mesonefro) para realizar las diferentes determinaciones en las gónadas embrionarias. Se abarca de este modo, desde el principio hasta el final de la determinación sexual y la diferenciación sexual embrionaria. Nos propusimos evaluar las características histo-morfológicas de la gónada embrionaria en los tres estadios estudiados y en todos los grupos experimentales mediante el procesado histológico del complejo GAM y posterior tinción tricrómica con picrosirius-hematoxilina. Además, nos planteamos establecer la ontogenia embrionaria gonadal de la expresión de proteínas implicadas en la proliferación celular (PCNA), daño del ADN (p63) y la apoptosis, como así también de la expresión de receptores hormonales: receptor de estrógenos α (REα) y receptor de progesterona (RP). Se realizó mediante procesado histológico y posterior inmunohistoquímica. Con el fin de evaluar la presencia de la enzima aromatasa específica para C. latirostris, en los diferentes estadios de desarrollo embrionario; debimos generar una proteína recombinante Glutatión-S-Transferasa-Aromatasa con el objetivo de utilizarla como antígeno para la producción de un anticuerpo policlonal anti-Aromatasa. Por otra parte, dado que el tamaño y disposición de las gónadas embrionarias no permiten que las mismas sean disecadas de manera quirúrgica, se obtuvieron las gonadas aisladas mediante la técnica de micropunción de Palkovits, y luego de esto se evaluó la expresión del ARNm de genes implicados en la determinación sexual y/o diferenciación gonadal: amh, sox9, sf1, aromatasa, mediante RT-PCR.Los resultados de nuestro trabajo se presentaron comparando por un lado, los aspectos sexualmente dimórficos de la DST, analizando machos-DST y hembras-DST. Por otro lado, se estudiaron comparativamente las hembras, aquellas obtenidas por DST y las obtenidas por DSE2. Finalmente, se evaluaron las características gonadales embrionarias de los machos, comparando aquellos obtenidos por DST y expuestos a vehículo (condición control) con aquellos obtenidos por DST pero expuestos a ATZ.En primera instancia, la evaluación de las características histo-morfológicas y la expresión de diferentes moléculas claves en el desarrollo embrionario a 30°C (TPH) y 33°C (TPM), nos permitió ampliar el conocimiento sobre el desarrollo ovárico y testicular embrionario de esta especie. Hallamos dimorfismo sexual presente entre las gónadas de hembras y machos de C. latirostris obtenidas por DST, en tres etapas del desarrollo embrionario (22, 24 y 27). La histoarquitectura gonadal embrionaria fue claramente diferente entre ambos grupos experimentales en el estadio 27 de desarrollo. Además, demostramos que las gónadas embrionarias muestran también diferencias en la expresión proteica de los receptores de estrógenos y progesterona de acuerdo al sexo, así como en la expresión de la enzima aromatasa. Observamos también, dimorfismo sexual en la proliferación celular y la posible incidencia de daño del ADN en las células germinales a través de la expresión de p63 en hembras. Finalmente, en la expresión génica hallamos patrones de expresión sexualmente dimórficos en todos los genes evaluados amh, sox-9 y cyp19-a1 (aromatasa) y sf-1. Ampliando de este modo el conocimiento sobre la determinación sexual y diferenciación gonadal de esta especie a nivel embrionario.Al analizar las similitudes y diferencias de las gónadas femeninas de C. latirostris en tres etapas del desarrollo embrionario, obtenidas por DST y DSE2, demostramos que la histoarquitectura gonadal comienza a mostrar diferencias entre estas hembras en la etapa embrionaria 24. Además, las gónadas de hembras-DSE2 muestran alteraciones en la expresión proteica de los receptores de estrógenos y progesterona, así como en la expresión de la enzima aromatasa, viéndose un incremento de la misma. Observamos también, un desequilibrio entre la proliferación celular y la apoptosis y la posible incidencia de daño del ADN en las células germinales en estas hembras, a través de la expresión de p63. Finalmente, hallamos diferencias entre estas hembras DST y DSE2 en la expresión de genes claves en el desarrollo gonadal como amh, sox-9 y cyp19-1a (aromatasa), en los estadios de desarrollo de mayor sensibilidad al ambiente, correspondientes al PTS. En resumen, nuestros resultados muestran que tanto en las condiciones DST como DSE2, se producen ovarios en embriones de C. latirostris. Sin embargo, esas gónadas son diferentes entre sí. Los cambios demostrados en embriones hembras-DSE2 reflejan la idea de que los compuestos ambientales con actividad estrogénica comprobada podrían alterar la funcionalidad ovárica de C. latirostris adulto, poniendo en peligro su salud reproductiva y el equilibrio de las poblaciones silvestres en el ecosistema.Con el objetivo de evaluar la acción de una sustancia con probada acción perturbadora endocrina, decidimos estudiar los efectos de la exposición in ovo a atrazina sobre la determinación sexual de C. latirostris. Encontramos modificaciones en la histoarquitectura testicular embrionaria en estadio 27 y cambios en moléculas claves del desarrollo gonadal, tanto a nivel proteico como a nivel génico, dos genes netamente vinculados a la diferenciación gonadal hacia testículo: amh y sox-9, se vieron modificados por la acción de atrazina. Pudimos describir el aumento de la expresión de aromatasa gonadal; la exposición a ATZ modificó de este modo, moléculas de la vía estrogénica. Se alteró también, la proliferación celular en los machos-ATZ, lo que podría estar relacionado a un mayor daño en el ADN de células germinales, ya en etapas tan tempranas como las del desarrollo embrionario. En resumen, todos los efectos generados, refuerzan la acción perturbadora endocrina ya comprobada de la atrazina, feminizando los tejidos reproductores masculinos. Esto es especialmente significativo en términos del impacto que la atrazina ambiental podría tener sobre el desarrollo y la reproducción de C. latirostris y tal vez sobre otras especies de vida silvestre.