Evaluación de nanoestructuras para sensores inmunológicos

Abstract

Esta tesis posee información confidencial, factible de patentamiento, por lotanto no será publicada hasta tanto se realice la protección de propiedad intelectual correspondiente.En este trabajo se estudiaron diferentes nanoestructuras para diferentes aplicaciones de biosensado. Se estudiaron también diferentes formas de funcionalización de los electrodos. Si bien en un principio la aplicación principal de estudio fueron los biosensores inmunológicos, las aplicaciones que se exploraronfueron mucho más amplias, logrando desarrollos muy interesantes y prometedores. Particularmente, el desarrollo de un biosensor para la detección de unaenfermedad muy grave en plantas cítricas, el HLB, permitió lograr un dispositivo que se encuentra en fase de patentamiento y prueba de factibilidad encampo.El primer material estudiado fue el ZnO, en diferentes formas nanoestructuradas, particularmente nanopartículas (NPs), nanohilos (NWs) y thin films(TFs). Para esto se desarrolló un biosensor de glucosa, el cual permite la cuantificación de concentraciones muy bajas de glucosa. El mismo presentó mejorsensibilidad que los biosensores de glucosa de primera generación, debido alempleo de nanoestructuras de óxido de zinc (NPs y NWs) en la superficie delbiosensor de pasta de carbón, a diferencia de la inmovilización en volumen comúnmente empleada en este tipo de sensores. Con esta metodología de inmovilización se abre la posibilidad de biosensores descartables, sensibles y de bajocosto. La cronoimpedancimetría fue la técnica utilizada para la determinaciónde la glucosa. Respecto de los TFs, se investigó el comportamiento del ZnO depositado como un film delgado nanoestructurado (TF) sobre un sustrato aislante eléctricamente (AlO3 o Zafiro). Se estudiaron las propiedades de transportede este nanomaterial mediante la espectroscopia de impedancia. Estas mediciones se realizaron analizando diferentes situaciones, como ser agregados desoluciones buffer y de glucosa en distintas concentraciones, con y sin enzimainmovilizada.8Otra nanoestructura estudiada fueron las NPs de Titanio, con las cuales sedesarrolló un biosensor para la detección del HLB. El mismo consiste en unbiosensor de inhibición, en el cual, las NPs de Ti permiten la inmovilizaciónde una cantidad adecuada de enzima en el biosensor para hacerlo lo suficientemente sensible. Estudiando NPs de Prussian Blue, se desarrolló también unsensor electroquímico para el mismo fin. Este sensor permite la medición demuy bajas concentraciones de peróxido de hidrógeno (H2O2).El HuangLongBing (HLB) es la enfermedad más destructiva de los cítricosen el mundo debido a la severidad de los síntomas. Hasta el momento no existeun tratamiento curativo, solo se adoptan medidas para evitar su expansión. Debido a que la enfermedad presenta un largo periodo de latencia presintomático(mayor a 6 meses) durante el cual se sigue produciendo la transmisión, la principal medida de lucha es un riguroso monitoreo de plantas y vectores, mediantemétodos de diagnóstico rápidos y sensibles a fin de responder inmediatamenteante la aparición del patógeno. Los métodos actuales para detectar al patógenoincluyen microscopía, serología y técnicas de biología molecular basadas en hibridización ADN-ADN y en reacciones de amplificación de secuencias de ADNespecíficas del patógeno, como PCR y LAMP. Por lo expuesto, y empleando lasnanoestructuras estudiadas, se buscó desarrollar un sistema de diagnóstico enbase a nanotecnología para detectar al mismo tiempo diferentes ?analitos marcadores? de la presencia de la bacteria en la planta, y en especial en sus primerosestadios, de tal forma que permita hacer una detección rápida, sensible, especifica, de bajo costo y que pueda ser realizada en campo, sin necesidad de llevarmuestras al laboratorio. Se evaluaron diferentes métodos de inmovilización dela enzima peroxidasa de rábano en diferentes sustratos. Se estudió como soporte polimérico al Tereftalato de polietileno (PET) y las formas de modificarlo paralograr la mejor funcionalización. Los agentes evaluados para la inmovilizaciónde la enzima fueron el Polyethylenimine (PEI), Chitosan, Glutaraldehido y dostipos de nanopartículas (de ZnO y óxido de titanio). El biosensor evalúa la actividad de la enzima peroxidasa cuando se colocan extractos de hojas de plantasde citrus en los cuales se simularon condiciones de enfermedad.El tercer sensor que se desarrolló, fue un sensor de H2O2, el cual es un importante analito presente en reacciones enzimáticas, industria y medicina. Seinvestigó el empleo de un compuesto reactivo al H2O2, el Prussian Blue (PB),el cual fue nanoestructurado de dos maneras, en forma de film (PBTF) y de nanopartículas (PBNPs). En el caso del PBTF, se electrodepositó usando dos técnicas diferentes, electroestática y electrodinámicamente sobre microelectrodos deplatino (ECC MDEA 5037-Pt; ABTECH Scientific, Inc.) y se estudiaron sus respuestas electroquímicas. El método potencioestático mostró una sensibilidad200 veces mayor que el potenciodinámico. Las PBNPs y su capacidad electrocatalítica sobre el H2O2, fue evaluada haciendo uso de dos electrodos, uno deoro y otro con óxido de iridio electrodepositado (EIROF) sobre oro. Con la técnica de síntesis de PBNPs y funcionalización de los electrodos se logró medirH2O2 de manera estable en medios básicos a 0V, presentando la mejor respuestael electrodo de nanoestructuras combinadas EIROF-PBNPs. Estos mismos electrodos se empelaron para evaluar la respuesta electroquímica frente a extractosetanólicos de hojas de plantas de citrus.Por último, para el estudio de los diferentes métodos de funcionalización delos sustratos para la inmovilización adecuada de los bioreceptores y nanoestructuras, y considerando que el ?drop-casting? es una técnica sencilla peroque no permite un control preciso sobre el diseño de los biosensores, se estudió por útlimo, la inmovilización de nanopartículas de ZnO sobre monocapasautoensambladas (SAMs). La inmovilización estable y homogénea de las nanoestructuras sobre sustratos sólidos es un factor clave para el desarrollo de lossensores. La estabilidad de las nanoestructuras se evaluó usando X-ray Photoelectron Spectroscopy (XPS), Contact Angle (CA) y Microscopía electrónica deBarrido (SEM). Por último, la funcionalización con anticuerpos y la deteccióndel antígeno específico se realizó mediante diferentes técnicas electroquímicas.