Evaluación de proteasas de origen vegetal libres y conjugadas como nuevos agentes trombolíticos y antiplaquetarios

Abstract

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte a nivel global. Esto promueve la constante búsqueda de nuevos agentes trombolíticos y antiplaquetarios. En este contexto distintas proteasas de origen vegetal han sido propuestas como potenciales fármacos. Previamente se ha reportado la purificación e identificación de la serín proteasa del tipo subtilisina de Solanum tuberosum, StSBTc-3. El objetivo de la presente tesis fue la evaluación de StSBTc-3 como un nuevo agente hemostático. Los resultados obtenidos mostraron que StSBTc-3 extendió el tiempo de coagulación de plasma rico en plaquetas, degradando todas las cadenas que constituyen el fibrinógeno humano (actividad fibrinogenolítica). StSBTc-3 también fue capaz de disolver parcialmente el coágulo de fibrina (actividad fibrinolítica). A partir de la optimización de la actividad fibrinogenolítica mediante el análisis de superficie de respuesta se vio que la enzima se mantuvo activa en un rango amplio de pH y temperaturas, encontrándose la máxima actividad a pH 8 y 43 C (próximas a las condiciones fisiológicas pH 7,45 y 37 C) . A su vez, StSBTc-3 no mostró actividad hemolítica sobre eritrocitos humanos. Se estudió la función plaquetaria en presencia de StSBTc-3, encontrándose que la misma inhibió la retracción del coágulo, afectando la agregación plaquetaria. Además, StSBTc-3 inhibió la agregación plaquetaria inducida por trombina, colágeno, convulxina y el ionóforo A23187. Se encontró que, a diferencia de la actividad fibrinogenolítica, la actividad antiplaquetaria no fue inhibida por el inhibidor de serín proteasas PMSF. Se clonó la región del gen codificante de StSBTc-3 en E. coli. La proteína pudo ser recuperada de la fracción soluble del lisado pero no mostró actividad proteolítica. Sin embargo, StSBTc-3 recombinante fue capaz de inhibir parcialmente la agregación plaquetaria inducida por trombina. El análisis bioinformático de la secuencia nucleotídica de StSBTc-3 indicó la presencia del dominio fibronectina III en la región codificante del C-terminal de la proteína. Al clonar la región del gen codificante de la proteasa sin incluir el dominio de fibronectina III, la proteína no pudo ser recuperada en la fracción soluble del lisado, encontrándose en cuerpos de inclusión. La inhibición de la actividad antiplaquetaria inducida por todos los agonistas ensayados sugirió que StSBTc-3 intervendría en los pasos finales del proceso de activación plaquetaria que conducen a la agregación, postulándose entonces que StSBTc-3 podría actuar como un inhibidor de la integrina plaquetaria 2b3a. El hecho de que la actividad antiplaquetaria de StSBTc-3 no fuera inhibida por PMSF, sumado al efecto antiagregante de StSBTc-3 recombinante, sugirió como posible mecanismo el bloqueo de la integrina debida a la unión a StSBTc-3 y no a su actividad proteolítica. La presencia del dominio fibronectina III representó un buen aval a dicha hipótesis, dado que se encuentra reportado que 2b3a posee afinidad por el mismo. La caracterización de StSBTc-3 presentada en este trabajo sugiere que la misma sería un potencial compuesto para ser tenido en cuenta en futuras aplicaciones biotecnológicas y ensayos in vivo.