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Tesis doctoral

Mecánica y dinámica del citoesqueleto en células vivas

Pallavicini, CarlaIcon
Director: Bruno, LucianaIcon
Codirector: Levi, ValeriaIcon
Consejero de estudios: Mindlin, Bernardo GabrielIcon
Fecha de publicación: 01/01/2018
Idioma: Español
Clasificación temática:
Otras Ciencias Físicas

Resumen

El citoesqueleto es una red auto-organizada y din ́amica presente en las c ́elu- las eucariotas. Esta ́ compuesto por tres tipos de biopol ́ımeros: filamentos de actina, filamentos intermedios y microtu ́bulos. Estos filamentos se constituyen a partir de la polimerizacio ́n de prote ́ınas ma ́s simples y forman estructuras con dia ́metros de ∼6nm para los filamentos de actina y ∼10nm para los filamentos intermedios. Los microtu ́bulos son los elementos ma ́s r ́ıgidos del citoesqueleto, con una estructura tubular de dia ́metro externo de ∼25nm. Estos biopol ́ımeros, en conjunto con pro- te ́ınas motoras, componen un entramado con propiedades meca ́nicas que permite a las c ́elulas generar y reaccionar ante la acci ́on de fuerzas.El citoesqueleto est ́a involucrado en numerosos procesos celulares tales como la migracio ́n, divisio ́n, contraccio ́n y el transporte de organelas. Por este motivo es muy importante estudiar el comportamiento meca ́nico de los filamentos del citoesqueleto para lograr un mayor conocimiento de la organizaci ́on y mec ́anica celular.La microscop ́ıa de fluorescencia ha revolucionado nuestro conocimiento del cito- esqueleto, permitiendo su visualizacio ́n en c ́elulas vivas. El ana ́lisis del movimiento y de las fluctuaciones en las formas de los filamentos del citoesqueleto permite estu- diar las propiedades meca ́nicas relevantes a su funcio ́n biolo ́gica. Este tipo de ana ́lisis requiere la identificaci ́on de las posiciones de filamentos individuales con alta pre- cisio ́n. Sin embargo, el seguimiento de filamentos individuales a partir de ima ́genes de microscop ́ıa de fluorescencia de c ́elulas vivas es extremadamente complejo.Es por ello que en la primera parte de esta Tesis, desarrollamos un algoritmo de tracking de filamentos que permite obtener las coordenadas de microtu ́bulos fluorescentes con precisi ́on subdifracci ́on. Evaluamos el rendimiento de esta rutina mediante simulaciones num ́ericas de ima ́genes confocales y experimentos in vitro y obtuvimos una precisio ́n de ∼9nm para filamentos in vitro y ∼20nm para filamentos en c ́elulas fijadas.Utilizando este algoritmo, estudiamos las distribuciones de curvaturas de mi- crotu ́bulos en c ́elulas melano ́foras de Xenopus laevis vivas. Mediante un ana ́lisis de Fourier de las formas de los filamentos hallamos que, en un entorno fuera del equili- brio como el citoplasma, las curvaturas se ajustaban a un comportamiento t ́ermico, de acuerdo con resultados reportados anteriormente. Estos datos fueron utilizados1para calcular la longitud de persistencia de los microtu ́bulos en distintas condiciones experimentales. La longitud de persistencia es un para ́metro ampliamente utilizado para describir las propiedades meca ́nicas de filamentos, y se define como la raz ́on entre la rigidez flexural del filamento y las fuerzas t ́ermicas actuando sobre el mismo. La longitud de persistencia efectiva calculada para microtu ́bulos en c ́elulas vivas fue ∼20 μm, valor significativamente menor que el medido in vitro. Este par ́ametro no se vio modificado en presencia de la prote ́ına asociada a microtu ́bulos XTP o la de- polimerizacio ́n de actina. En contraste, la depolimerizacio ́n de la red de filamentos intermedios disminuyo ́ significativamente el valor de este para ́metro.Por otra parte, exploramos si la inhibici ́on de los eventos de polimerizacio ́n y de- polimerizacio ́n de los microtu ́bulos podr ́ıa afectar su rigidez flexural efectiva. En este caso, la distribucio ́n de formas de los filamentos no se ajusto ́ a un comportamien- to t ́ermico, como el observado en c ́elulas control, indicando que el comportamiento meca ́nico de los microtu ́bulos depende de un delicado equilibrio de fuerzas activas dentro de la c ́elula.Observamos que la depolimerizacio ́n de filamentos de actina e intermedios au- menta significativamente las fluctuaciones laterales de los microtu ́bulos, sugiriendo que estos filamentos contribuyen a la organizacio ́n global de dicha red. Por otra par- te, verificamos que la produccio ́n de fuerzas no es homog ́enea dentro de las c ́elulas ya que los microtu ́bulos presentaban un movimiento ma ́s lento, pero ma ́s direccionado en la regio ́n cortical en comparacio ́n con la regio ́n perinuclear.En la segunda parte de esta Tesis, estudiamos los aspectos dina ́micos de los eventos de buckling de microtu ́bulos en c ́elulas melano ́foras de Xenopus laevis. E ́stos son eventos transitorios y localizados observados frecuentemente en c ́elulas, y se caracteriza por una r ́apida flexio ́n del filamento seguida de su relajacio ́n. Se ha propuesto que estos eventos de ra ́pida deformaci ́on dependen de fuerzas localizadas espacio-temporalmente resultantes de la accio ́n de motores moleculares.Para comprender este fen ́omeno, caracterizamos los eventos de buckling median- te el tracking de microtu ́bulos fluorescentes individuales en combinaci ́on con simu- laciones num ́ericas, las cuales nos permitieron explorar distintos mecanismos que podr ́ıan producir la flexi ́on de filamentos. Los eventos simulados reprodujeron mu- chas de las caracter ́ısticas observadas en microtu ́bulos en c ́elulas vivas, sugiriendo que el modelo mec ́anico implementado representaba los procesos esenciales del buc- kling de microtu ́bulos. Luego analizamos la interacci ́on entre ves ́ıculas fluorescentes transportadas activamente y la red de microtu ́bulos pudiendo as ́ı observar eventos generados por fuerzas activas y correlacionarlos con el movimiento de las ves ́ıcu- las. Los resultados obtenidos de este an ́alisis sugieren que los microtu ́bulos podr ́ıan afectar el transporte indirectamente, aparte de servir como v ́ıas para las organelas transportadas.2Con el fin de extender nuestro ana ́lisis del citoesqueleto a otros sistemas biol ́ogi- cos, estudiamos c ́elulas de ca ́ncer de pr ́ostata, que muestran una expresi ́on anormal de prote ́ınas del citoesqueleto, resultando en una resistencia a la quimioterapia y ca- pacidad de colonizar o ́rganos lejanos. Desarrollamos t ́ecnicas computacionales para analizar im ́agenes de fluorescencia de citoesqueleto en estas c ́elulas y, en particular, cuantificar la acci ́on de una droga que induce la expresio ́n de Hemo oxigenasa-1, una enzima implicada en la regulacio ́n de la morfolog ́ıa celular. Nuestros resultados mostraron que la c ́elulas bajo la induccio ́n de HO-1 presentaban menos migracio ́n y una proporcio ́n significativamente mayor de protrusiones tipo-filopodias que las c ́elulas control, los que indicar ́ıa una mayor comunicacio ́n entre c ́elulas vecinas.En s ́ıntesis, llevamos a cabo experimentos biol ́ogicos para observar el citoesquele- to y desarrollamos t ́ecnicas que nos permitieron estudiar estos filamentos en c ́elulas vivas. De esta forma, pudimos analizar cuantitativamente la importancia del balance y din ́amica de fuerzas activas en c ́elulas para la organizacio ́n de la red de microtu ́bu- los. Estos conocimientos tambi ́en fueron de utilidad para analizar los cambios en el citoesqueleto de c ́elulas de ca ́ncer de pro ́stata.
Palabras clave: Citoesqueleto , Microscopía de Fluorescencia , Microtúbulos , Tracking de Filamentos , Buckling de Filametos , Cáncer de Próstata
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Identificadores
URI: http://hdl.handle.net/11336/85018
URL: https://digital.bl.fcen.uba.ar/download/tesis/tesis_n6316_Pallavicini.pdf
Colecciones
Tesis(IFIBA)
Tesis de INST.DE FISICA DE BUENOS AIRES
Citación
Pallavicini, Carla; Bruno, Luciana; Levi, Valeria; Mindlin, Bernardo Gabriel; Mecánica y dinámica del citoesqueleto en células vivas; 1-1-2018
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