TcTASV: Familia de proteínas de superficie de Trypanosoma cruzi. Su aplicación en el inmunodiagnóstico de la infección chagásica en humanos y reservorios domésticos

Abstract

La enfermedad de Chagas causada por Trypanosoma cruzi afecta actualmente a millones de personas en América Latina y el mundo. El apropiado diagnóstico del paciente chagásico, cualquiera sea su edad y etapa infectiva, es fundamental para el pronóstico, tratamiento y prevención de la transmisión. La Organización Mundial de la Salud ha resaltado la necesidad del perfeccionamiento de las herramientas diagnósticas disponibles para la infección por este parásito o el desarrollo de nuevas. Las técnicas serológicas convencionales además de llevar a resultados inconclusos, resultan inespecíficas ante infecciones con patógenos emparentados y co-endémicos como Leishmania spp. Estudios multicéntricos han reportado que el desempeño de los kits convencionales, además, varía según la procedencia de las muestras. Este fenómeno se atribuye a que las muestras en estudio pertenezcan a individuos infectados con distintos linajes de diferentes regiones. Se requiere de plataformas diagnósticas sensibles y específicas que superen estas dificultades y puedan ser utilizadas en centros sin especialización y en zonas rurales (técnicas POC, "Point of care"). A esto, se suman la falta de una prueba que permita la determinación de cura en pacientes tratados y las limitaciones a la hora de detectar la infección en pacientes congénitos durante los primeros meses de vida. Por otro lado, se requieren de herramientas para la vigilancia epidemiológica en áreas endémicas en donde la detección de la infección en reservorios domésticos, como ser los perros, es fundamental para evaluar el riesgo de transmisión al hombre. La descripción de la familia TcTASV, la última familia multigénica de T. cruzi en ser descubierta, devino en el planteamiento de esta tesis. Los miembros TcTASV se agrupan en cuatro subfamilias: A, B, C y W, y, en general, poseen características potencialmente útiles para el diagnóstico serológico de la infección chagásica: se expresan en la superficie del parásito, diferencialmente en el tripomastigote, y no comparten homología de secuencias con los genomas de Leishmania spp. El objetivo de esta tesis, en vista de las problemáticas especificadas, fue estudiar la aplicabilidad de estas proteínas recientemente descubiertas para la detección de la infección chagásica tanto en humanos como en reservorios domésticos.En la resolución de este trabajo, en primer lugar, nos enfrentamos al desafío de clonar y expresar estas proteínas en estado soluble para poder utilizarlas en los ensayos de inmunodiagnóstico. Una vez ajustados los protocolos de producción de las proteínas recombinantes estandarizamos los ensayos de ELISA para la detección de anticuerpos anti-TcTASV en humanos y en perros. Hemos demostrado que los antígenos TcTASV-A y TcTASV-C son específicos para la determinación de la infección tanto en humanos como en perros, ya que ninguno de los sueros de individuos sanos, leishmaniásicos o con estrongiloidiosis estudiados reaccionaron ante los mismos. Si bien la sensibilidad de los antígenos individualmente evaluados resultó de baja a moderada, la combinación de los mismos en el ensayo de ELISA-Mix A+C permitió la detección de un alto porcentaje de muestras de individuos infectados tanto para el caso de humanos como para los reservorios domésticos estudiados aquí. Además, el ELISA-Mix A+C demostró ser una técnica de elevado desempeño para el caso particular de pacientes pediátricos. Sumado a esto, logró detectar de forma temprana el impacto del tratamiento en mencionados pacientes: la disminución de anticuerpos anti-TcTASV se evidenció en un mayor porcentaje de pacientes, con respecto a la disminución de anticuerpos anti-T. cruzi totales, determinados por serología convencional.Por otro lado, siendo los perros el reservorio de mayor importancia en el ciclo doméstico de este parásito, estudiamos el desempeño diagnóstico de los antígenos TcTASVs para la detección de la infección por T. cruzi en perros infectados naturalmente de áreas endémicas. En concordancia con otros resultados de nuestro grupo observamos que TcTASV-C, principalmente, y TcTASV-A, serían indicadores de infección activa. Por lo tanto, los perros reactivos ante los antígenos TcTASV-A y -C podrían tener un mayor impacto epidemiológico al representar una fuente mayor de parásitos para un vector no infectado que se alimente de éstos. Dada su liberación al medio tanto en forma soluble como contenida en vesículas, estudiamos la presencia de TcTASV-C en el suero de perros infectados a modo de un biomarcador de infección, mediante un ensayo de Western Blot. Los resultados positivos fueron corroborados mediante la captura del antígeno en el suero de perros infectados utilizando columnas de afinidad específicas preparadas en el laboratorio. Los resultados obtenidos podrían derivar en el uso de TcTASV-C como candidato para el desarrollo de pruebas diagnósticas rápidas a ser aplicadas en zonas endémicas para detectar reservorios con infección activa.Los resultados de este trabajo, demuestran que los antígenos TcTASV, o péptidos derivados de sus secuencias, podrían ser sumados a plataformas de diagnóstico contribuyendo positivamente a las problemáticas planteadas. Por otro lado, y no menos importante, aportan evidencia sobre la expresión de estas proteínas recientemente descubiertas durante el curso natural de la infección por T. cruzi en los distintos hospedadores del ciclo doméstico. Se requieren de mayores estudios para confirmar la utilidad diagnóstica de las proteínas TcTASV y para elucidar su rol en la biología de T. cruzi y en su interacción con los hospedadores mamíferos.

Chagas' disease produced by Trypanosoma cruzi currently affects millions of people in Latin America and the world. The proper diagnosis of chagasic patients, regardless of age and infective stage, is essential for the prognosis, treatment and prevention of transmission of the disease. The World Health Organization has highlighted the need to improve the diagnostic tools available for the detection of the infection by this parasite or the development of new ones. Conventional serological techniques, besides leading to inconclusive results, are non-specific to infections with related and co-endemic pathogens such as Leishmania spp. Multicenter studies have reported that the performance of conventional kits also varies according to the provenance of the samples. This phenomenon is attributed to the fact that the samples under study belong to individuals infected with different lineages from different regions. Sensitive and specific diagnostic platforms able to overcome these difficulties and applicable in non-specialized centers and in rural areas (POC techniques, Point of care), are needed. In addition, there is a lack of a test that allows the determination of cure in treated patients and there are serious limitations in detecting infection in congenital patients during the first months of life. On the other hand, tools are needed for epidemiological surveillance in endemic areas where the detection of infection in domestic reservoirs, such as dogs, is essential to evaluate the risk of transmission to humans. The description of the TcTASV family, the last multigenic family of T. cruzi to be discovered, encouraged the presentation of this thesis. The TcTASV members are grouped into four subfamilies: A, B, C and W, and, in general, have potentially useful characteristics for the serological diagnosis of chagasic infection: they are differentially expressed in the trypomastigote stage, mostly on the surface of parasites, and do not share sequence homology with the genomes of Leishmania spp. The objective of this thesis, in view of the mentioned problems, was to study the applicability of these recently discovered proteins for the detection of chagasic infection in both humans and domestic reservoirs. In the resolution of this work, we first faced the challenge of cloning and expressing these proteins in a soluble state for its use in immunodiagnostic assays. Once the production protocols of the recombinant proteins were adjusted we standardized ELISA assays for the detection of anti-TcTASV antibodies in humans and dogs. We showed that the TcTASV-A and TcTASV-C antigens are specific for the determination of infection in both humans and dogs, since none of the sera from healthy, Leishmania spp. or Strongyloides stercoralis infected patients studied here reacted against them. Although the sensitivity of the antigens individually evaluated was low to moderate, their combined use in the ELISA-Mix A+C assay allowed the detection of a high percentage of samples from infected individuals both for humans and dogs. In addition, the ELISA-Mix A+C proved to be a high performance technique for the particular case of pediatric patients. Also, it was able to detect early the impact of treatment in the mentioned patients: the reduction of anti-TcTASV antibodies was evidenced in a greater number of patients, compared to the decrease of anti-T. cruzi antibodies determined by conventional serology, in the follow up period studied. On the other hand, since dogs are the most important reservoir in the domestic cycle of this parasite, we studied the diagnostic performance of TcTASVs antigens for the detection of T. cruzi infection in naturally infected dogs from endemic areas. In agreement with other results of our group we observed that TcTASV-C, mainly, and TcTASV-A, would be indicators of active infection. Therefore, dogs reactive to the TcTASV-A and -C antigens may have a greater epidemiological impact as they represent a larger source of parasites for an uninfected vector that feeding from them. Due to its release into the medium both in soluble form and contained in vesicles, we studied the presence of TcTASV-C in the serum of infected dogs as a biomarker of infection by a Western Blot assay. Positive results were corroborated by capture of the antigen in the serum of infected dogs using specific affinity columns prepared in the laboratory. The results obtained could lead to the use of TcTASV-C as a candidate for the development of rapid diagnostic tests to be applied in endemic areas to detect reservoirs with active infection. The results of this work demonstrate that TcTASV antigens, or peptides derived from their sequences, could be added to diagnostic platforms contributing positively to the problems raised. On the other hand, and not least, these results provide evidence on the expression of these newly discovered proteins during the natural course of T. cruzi infection in the different hosts of the domestic cycle. Further studies are needed to confirm the diagnostic utility of TcTASV proteins and to elucidate their role in the biology of T. cruzi and in their interaction with mammalian hosts.