Resistencia a la terapia fotodinámica en un modelo de microambiente tumoral: Implicancias de la autofagia activada por HIF-1

Abstract

El estudio de las interacciones celulares en el microambiente tumoral se ha convertido en una de las principales áreas de investigación en la lucha contra el cáncer. La hipoxia y la autofagia han sido reconocidas como fenómenos activos en el microambiente tridimensional de los tumores sólidos debido a la pobre difusión de oxígeno y nutrientes en regiones alejadas de los capilares sanguíneos. La respuesta celular a la hipoxia está mediada principalmente por el factor de transcripción HIF-1 el cual modula la activación de la angiogénesis y vías de supervivencia que permiten la adaptación de la célula tumoral a este microambiente hostil. Además, resulta interesante que, en los últimos años, se ha demostrado que dicho factor puede inducir la activación de la vía autofágica, un mecanismo que promueve la supervivencia celular bajo diferentes condiciones de estrés. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes, a través de los cuales HIF-1 induce autofagia, necesitan ser estudiados con detalle. Tanto HIF-1 como la autofagia han sido vinculadas a la resistencia a tratamientos antitumorales incluyendo la Terapia Fotodinámica (TFD). La TFD consiste en la aplicación de fotosensibilizadores que al ser irradiados producen Especies Reactivas del Oxígeno, las cuales provocan a la muerte del tumor. Sin embargo, no hay reportes que demuestren la implicancia de la autofagia mediada por HIF-1 sobre la respuesta tumoral a la TFD. En este trabajo, se emplearon tres modelos de estudio (cultivos en monocapa, cultivos tridimensionales y tumores in vivo) y evaluó cómo HIF-1 y la autofagia trabajan juntos para modular la respuesta celular a la TFD, además, se estudió el mecanismo molecular a través del cual HIF-1 controla autofagia para mediar la resistencia de células tumorales de cáncer de colon al tratamiento fotodinámico.Se demostró que la activación de HIF-1, induce autofagia a través de un nuevo mecanismo que involucra la regulación transcripcional de la proteína autofágica VMP1. HIF-1 aumentó el flujo autofágico determinado por un aumento de la relación LC3-II/LC3-I, disminución de p62, aumento de VMP1 y agregación de RFP-LC3. Asimismo, la autofagia inducida por HIF-1 promueve resistencia a la TFD. Por otro lado, se demostró que el tratamiento fotodinámico, per se, puede inducir autofagia a través de la activación de la vía HIF-1/VMP1.Empleando cultivos 3D que recapitulan la arquitectura tridimensional de los tumores sólidos así como algunas de las características biológicas observadas en pacientes con cáncer, tales como la hipoxia, se estudió la naturaleza molecular de la resistencia a la TFD en un contexto de microambiente tumoral y revelamos, por primera vez, que la resistencia intrínseca a la TFD, observada en los cultivos 3D, puede ser explicada en términos de una ?autofagia protectora? controlada por HIF-1.Por último, se evaluó el efecto de la inhibición farmacológica de la autofagia con Cloroquina (CQ) sobre el crecimiento tumoral. Se generaron tumores en ratones inmunodeprimidos y los animales se trataron con TFD, CQ o TFD+CQ. Los tumores fueron resistentes a la TFD. Sin embargo, hubo una disminución del 40% del crecimiento tumoral cuando la autofagia fue inhibida con CQ y la combinación TFD+CQ redujo dramáticamente el crecimiento de los tumores en un 75% respecto al tratamiento con TFD.En conclusión, esta tesis reporta por primera vez que: 1- HIF-1 controla autofagia a través de la regulación de la expresión de VMP1; 2- La TFD induce autofagia, a través de la vía HIF-1/VMP1, como mecanismo de resistencia; 3- Los cultivos tridimensionales son resistentes a la TFD debido, al menos en parte, a la actividad autofágica intrínseca dependiente de HIF-1; 4- La combinación de TFD con el inhibidor farmacológico Cloroquina, sensibiliza los tumores resistentes al efecto fototóxico.

The analysis of cellular interactions in the tumor microenvironment has generated great interest in the cancer research. It has been shown that hypoxia and autophagy may be induced in the three-dimensional environment of solid tumors due to cancer cells can quickly outgrow the existing vasculature and have decreased access to nutrients and oxygen. The Hypoxia Inducible Factor-1 (HIF-1) is the major regulator for resistance to cell death and proliferation of cancer cells by providing a growth advantage under hypoxic stress. Recently, it has been shown that in response to hypoxia, cells can induce HIF-1-mediated autophagy to survive in this hostile microenvironment. However, the molecular mechanisms by which HIF-1 induces autophagy need to be explored in detail. HIF-1 and autophagy can promote resistance to anticancer treatments including PDT. PDT consist in the use of a light-sensitizing agent, or photosensitizer (PS), followed by illumination of the tumor with visible light; this leads to the production of reactive oxygen species (ROS) that cause direct damage to the tumor. However, the interplay between HIF-1 and autophagy in PDT context has not studied yet. Here, we employed three type of cultures models (monolayer cultures, three-dimensional cultures and xenograft model) and examine how hypoxia and autophagy work together to modulate cancer cell response to PDT and the molecular pathways by which HIF-1 induces autophagy to mediate photodynamic therapy resistance in colon cancer cells. We found that HIF-1 promotes autophagy by increasing expression of VMP1, LC3II processing, RFP-LC3 aggregation and decreasing level of p62. Moreover, HIF-1-induced autophagy promotes resistance to PDT. On the other hand, PDT induces autophagy as a survival mechanism in colon cancer cells by induction of the novel HIF-1α/VMP1 pathway. Employing three-dimensional cultures of colon cancer cells that recapitulate the architecture of solid tumors and same of the biological features observed in cancer patients, such as hypoxia which was widely related to tumor resistance to chemo-radiotherapy, we addressed the molecular nature of PDT resistance in a tumor microenvironment context and revealed for the first time that intrinsic resistance tophotodynamic therapy in 3D spheroid, can be molecularly explained in terms of protective autophagy triggered by HIF-1 factor. Finally, the effect of systemic inhibition of autophagy flux by chloroquine (CQ) treatment on tumor growth were evaluated in vivo using a xenograft animal model. These animals were treated with PDT, CQ, combination PDT+CQ or non-treated (NT) and tumor growth was analyzed. PDT treatment failed to prevent tumor growth in animals xenografted with colon cancer cells. However, the tumor growth rate after inhibition of autophagic flux by systemic CQ treatment was significantly smaller (40%). Remarkably, co-treatment of the chloroquine-treated xenograft with PDT shows a dramatic reduction of tumor growth (75%). Conclusions: This work reveals for the first time: 1- HIF-1 modulates autophagy by a novel HIF-1/VMP1 pathway; 2- PDT induce HIF-1/VMP1/Autophagy as resistance mechanism; 3- The intrinsic HIF-1-dependent autophagic activity of 3D spheroids confers resistance to PDT; 4- The combination of PDT + Chloroquine sensitizes tumor of colon cancer cells to PDT effect.