Importancia de los mecanismos de quorum sensing en las interacciones entre microorganismos endofíticos

Abstract

Los sistemas de quorum sensing (QS), son mecanismos de comunicación que modifican la fisiología microbiana e intervienen en las interacciones entre los microorganismos. Se conoce que estos mecanismos regulan aspectos claves en la fisiología de organismos patógenos y benéficos. Por ello, en los últimos años, han despertado un particular interés en el área biotecnológica orientada principalmente al campo agronómico. Los sistemas de QS se caracterizan por la síntesis de moléculas señal, siendo los mediados por N-acil homoserinlactonas (AHLs) uno de los más estudiados. Existen, a su vez, organismos que han desarrollado una estrategia conocida como quorum quenching (QQ) para interrumpir el mecanismo de QS. En conjunto ambos sistemas tienen la capacidad de intervenir no solo en las interacciones intraespecies sino además en las interespecies. En base a lo expuesto, se planteó como objetivo general del presente trabajo de Tesis doctoral contribuir al mejoramiento en la utilización de microorganismos endofíticos mediante el estudio de los mecanismos regulatorios de quorum sensing en las interacciones entre bacterias, levaduras y la planta hospedera. Inicialmente, se aislaron bacterias y levaduras endofíticas de caña de azúcar. En bacterias, se estudió la capacidad de sintetizar AHLs. Agrobacterium tumefaciens 6N2 además de producir las moléculas de QS se destacó por presentar propiedades promotoras del crecimiento vegetal. Seguidamente, se secuenció el genoma de la bacteria encontrándose un complejo sistema de quorum sensing responsable de sintetizar 3-OH-C8-HSL, 3-OH-C10-HSL y 3-OH-C12-HSL como moléculas de señalización. Por otro lado, se determinó en las levaduras endofíticas, la existencia de sistemas de quorum quenching. Entre los aislamientos, Rhodotorula sp. 6Apo y Rhodotorula sp. 7Apo1 sobresalieron por degradar las AHLs ensayadas. Con el objetivo de conocer el efecto de las AHLs sobre la fisiología de las levaduras, se evaluó la respuesta de Meyerozyma guilliermondii 6N, otra levadura endofítica, frente al estrés oxidativo generado con hidroperóxido de tert butilo y cobre en presencia de las moléculas de señalización. Los resultados indicaron que la sensibilidad de la levadura aumentó en presencia de las AHLs y que la misma fue dosis dependiente. En este trabajo se comparó también el proteoma intracelular de A. tumefaciens 6N2 y M. guilliermondii 6N en cultivos puros y mixtos de los microorganismos demostrando que el sistema de QS de la bacteria reguló no solo la expresión de sus propias proteínas sino también las de M. guilliermondii 6N. Además, la levadura fue capaz de generar un cambio en la expresión de proteínas reguladas por el sistema de comunicación bacteriano. Finalmente, para conocer la existencia de variaciones fisiológicas en ambos microorganismos, se estudiaron alteraciones en la población celular en cultivos puros y mixtos de A. tumefaciens 6N2 y M. guilliermondii 6N evidenciados por citometría de flujo. Los datos obtenidos indicaron que M. guilliermondii 6N al ser cultivada con A. tumefaciens 6N2 presentó un cambio en su fisiología. Estos resultados reflejan que los sistemas de QS y QQ son de gran importancia no solo en la regulación de la fisiología del microorganismo productor sino además en las interacciones intra e inter especies.

Quorum sensing (QS), is a cell-to-cell communication process that enables microorganisms to collectively modify their physiology. Noteworthy, these mechanisms are involved in the regulation of pathogenic and non-pathogenic organisms’ behaviour. Therefore, in the recent years, the biotechnological interest in QS systems has come to light especially in agronomic field. Quorum sensing involves the production of extracellular signaling molecules. While several distinct families of QS systems have been described, the most intensively studied QS signaling system relies on the production of N-acylhomoserine lactones (AHLs). On the other hand, some microorganisms have developed a sort of strategy in order to disrupt QS, called quorum quenching (QQ). Both systems, QS and QQ, are capable of meddling interactions among microorganisms belonging to the same kingdom as well as those present in cross kingdom. Regarding what has been previously described, the aim of the present thesis project was to improve the biotechnological application of plant growth promoting microorganisms by studying quorum sensing systems involved in the interactions among endophytic bacteria and yeasts, and the host plant. Firstly, bacteria and yeast from sugar cane were isolated. In addition, the bacterial capacity of releasing AHLs was studied. Agrobacterium tumefaciens 6N2 highlighted among their counterparts because its ability for producing AHLs and showing plant growth promoting features. The genome sequence of 6N2 was obtained and the presence of a complex QS system in this bacterium was confirmed. Its QS mechanism was responsible of synthetizing 3-OH-C8-HSL, 3-OH-C10-HSL and 3-OH-C12-HSL. On the other hand, quorum quenching systems in endophytic yeasts was studied. Rhodotorula sp. 6Apo and Rhodotorula sp. 7Apo1 outshined the other isolates due to the fact that both yeasts inactivated all AHLs tested. With the particular aim of knowing how AHLs changed yeast physiology, the oxidative stress response to bacterial QS molecules of Meyerozyma guilliermondii 6N, another endophytic yeast isolated from sugarcane, was characterized. M. guilliermondii 6N was stressed by tert-butyl hydroperoxide and cooper. The findings showed that the response of the yeast to the stressors was affected by the presence of AHLs. The observed responses were directly related to the concentrations of the AHLs. Hence, the higher AHL concentration, the higher sensibility yeast showed. In addition, label free proteomics was performed in order to characterize protein intracellular profiles of A. tumefaciens 6N2 and M. guilliermondii 6N. Mixed cultures of both microorganisms as well as pure cultures were prepared. Data showed that bacterial QS system affected not only its own protein expression but also the yeast ones. Furthermore, M. guilliermondii 6N modulated protein expression regulated by bacterial QS mechanism. Lastly, variations in cellular population of A. tumefaciens 6N2 and M. guilliermondii 6N by flow cytometry were studied. Both microorganisms were grown alone or in mixed cultures. Findings obtained in this work demonstrated that A. tumefaciens 6N2 orquestrated changes in yeast physiology. The features analyzed in the present project exhibit that QS and QQ systems underlie physiology behaviour not only in the carrier organism but also in intra- and inter-species cell–cell communication.