Capacidad biocida de hongos entomopatógenos para el control de plagas del tabaco (Nicotiana tabacum L.) en la provincia de Jujuy, República Argentina

Abstract

Las plagas son las principales responsables de las mermas en los rendimientos de las cosechas, su control se realiza casi exclusivamente a través del control químico, mediante el empleo de insecticidas, fungicidas y herbicidas, prevaleciendo el uso de aquellos de amplio espectro (organoclorados, organofosforados, carbamatos y piretroides). Estos productos no sólo han contaminado las fuentes de agua y deteriorado la fertilidad de los suelos, sino también han afectado la fauna y la salud humana. La provincia de Jujuy es una de las principales productoras de tabaco en el país y su cultivo reviste importancia desde el punto de vista socioeconómico y productivo, ya que es el cultivo con mayor rentabilidad. El tabaco es atacado por un variado número de organismos durante todo su ciclo, provocando como consecuencia la reducción de los rendimientos y de la calidad del producto cosechado. Entre los insectos plaga del tabaco pueden mencionarse los “Gusanos blancos” Dyscinetus spp. (Coleoptera: Scarabaeidae), la “Vaquita de San Antonio” Diabrotica speciosa (Coleoptera: Chrysomelidae), la “Pulguilla del tabaco” Epitrix argentinensis (Coleoptera: Chrysomelidae), “trips” Frankliniella spp. (Thysanoptera: Thripidae), los “pulgones” Myzus spp. (Hemiptera: Aphididae), las “moscas blancas” Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), el “minador del tallo del tabaco” Faustinus cubae (Coleoptera: Curculionidae), el “complejo cogollero” integrado por lepidóteros del género Helicoverpa (Lepidoptera: Noctuidae) y la especie Manduca sexta. Con el objetivo de mitigar los efectos adversos que devienen de la agricultura tradicional han surgido nuevos enfoques que permiten resolver los problemas de la producción agraria de una manera sostenible. Uno de ellos es el Manejo Integrado de Plagas (MIP), que es un sistema de protección vegetal que emplea diversas técnicas y que pretende ser persistente en el tiempo y justificable ambiental y económicamente. Una de las estrategias que emplea es el Control Biológico (CB), en dónde se utilizan organismos presentes naturalmente en el ambiente o no, para reducir la densidad poblacional de aquellos organismos considerados plaga. Los hongos entomopatógenos son agentes de CB eficaces por su alta especificidad, dispersión natural, posibilidad de cultivo in vitro manteniendo la patogenicidad, inocuidad para vertebrados y la posibilidad de provocar un control permanente una vez establecidos en el ambiente. A pesar de las ventajas mencionadas previamente, cuando se desea realizar un formulado con este tipo de microrganismos es importante tener en cuenta ciertos factores ambientales como la temperatura, humedad y exposición a la luz solar para garantizar el éxito de estos hongos. El término “endófito” se utiliza para designar a aquellos organismos que habitan dentro de las plantas durante algún período de su ciclo de vida colonizando los tejidos internos de estas y sin causarles daño aparente. Los hongos endófitos han sido aislados naturalmente de todas las plantas estudiadas hasta el momento y se han encontrado colonizando semillas, tallos, hojas entre otros órganos y tejidos vegetales. La utilización de los hongos entomopatógenos como endófitos es una reciente herramienta que puede ofrecer oportunidades para mejorar la eficacia del control biológico ejercida por estos microorganismos como alternativa a las aplicaciones convencionales de micoinsecticidas. Los hongos Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill., Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokīn, Lecanicillium lecanii (Zimm.) Zare & W. Gams y Paecilomyces farinosus (Holmsk.) A.H.S. Br. & G. Sm. han sido aislados como endófitos de distintas especies de plantas, mientras que otros han sido inoculados artificialmente en plantas mediante diversas técnicas, con el objetivo final de controlar a distintas especies de insectos plagas que pudieran atacarlas. Teniendo en cuenta los antecedentes previamente expuestos el presente trabajo de Tesis Doctoral tuvo como objetivos: 1) caracterizar las comunidades de hongos endófitos presentes naturalmente en el cultivo de tabaco de la provincia de Jujuy, 2) realizar la prospección, detección y aislamiento de hongos entomopatógenos nativos en los insectos plaga y suelos del cultivo, 3) caracterizar las cepas aisladas morfológica y molecularmente, así como también por su capacidad biocida frente a plagas del cultivo de tabaco, 4) evaluar la capacidad endofítica de los hongos entomopatógenos aislados en condiciones de laboratorio mediante la técnica de aspersión foliar, y finalmente 5) evaluar la preferencia alimenticia, efectos sub-letales y patogenicidad sobre los insectos plaga del cultivo de tabaco, que se alimenten de plantas inoculadas con la cepa del hongo entomopatógeno con mejor capacidad endofítica. Como resultado de los muestreos realizados en las fincas tabacaleras de la provincia de Jujuy, pudieron aislarse un total de 1588 cepas de hongos endófitos presentes naturalmente en plantas de tabaco Virginia (variedad K394) pertenecientes a los Phyla Ascomycota y Zygomycota. Estas fueron asignadas a 31 morfoespecies; 516 cepas fueron aisladas de las raíces, 504 de los tallos y 568 de las hojas. El análisis de componentes principales realizados permitió establecer que la mayoría de los aislamientos estuvieron presentes en un solo órgano. A partir de muestras de suelo del cultivo de tabaco y aplicando la metodología de dilución seriada en medio selectivo, se aislaron 20 cepas de hongos entomopatógenos, de las cuales 11 correspondieron a la especie B. bassiana, 8 a P. lilacinum y 1 a M. anisopliae. El análisis de diversidad utilizando marcadores ISSR demostró que aquellas cepas de B. bassiana y P. lilacinum con mayor virulencia frente a las plagas Helicoverpa gelotopoeon (Lepidoptera: Noctuidae) y D. speciosa (Coleoptera: Chrysomelidae) generaban patrones de bandas similares. Con el fin de evaluar la capacidad endofítica de las distintas cepas de hongos entomopatógenos se aplicaron mediante aspersión foliar soluciones de conidios a plantas de tabaco. Se calculó el porcentaje de colonización de las cepas sobre las raíces, tallos y hojas de las plantas a los 7, 14, 21 y 28 días postinoculación. La cepa de B. bassiana LPSc 1215, fue la que mayor capacidad endofítica mostró en los distintos órganos. Los efectos de la cepa de B. bassiana LPSc 1215 como endófito sobre el consumo de adultos de D. speciosa y larvas de H. gelotopoeon, obtenidos del campo y criados con dieta artificial en laboratorio respectivamente, se analizó mediante “choice test”. Esta cepa no logró reducir significativamente la cantidad de tejido vegetal consumido por los insectos. Por otra parte, se evaluaron efectos letales y sub-letales del mismo entomopatógeno cómo endófito sobre H. gelotopoeon. La supervivencia, fertilidad y longevidad larval del insecto se vieron negativamente afectadas por la presencia del endófito, mientras que en los adultos afectó negativamente el tiempo generacional, el período de oviposición, la fecundidad y la fertilidad de los huevos. Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral permiten concluir que el aislamiento nativo LPSc 1215 de B. bassiana obtenido a partir de muestras de suelo del cultivo de tabaco de la provincia de Jujuy, podría ser incorporado, a través de su colonización endofítica, como agente de control del lepidóptero plaga H. gelotopoeon en programas de protección vegetal.

Insect pests are the main responsible for the decline in crop yields, their control is carried out through chemical control, employing insecticides, fungicides and herbicides, prevailing the use of broad spectre insecticides (organochlorines, organophosphorus, carbamates and pyrethroids). These products have polluted water sources and impaired soil fertility, and have affected wildlife and human health as well. Jujuy province is one of the main tobacco producer in Argentina and its growth becomes relevant from a socio-economic and productive point of view since it is the most profitable crop in the region. Many organisms attack the tobacco crop during its cycle, causing losses in yield and quality of the harvested product. Among insect pests “White worms” Dyscinetus spp. (Coleoptera: Scarabaeidae), “Cucurbit beatle” Diabrotica speciosa (Coleoptera: Chrysomelidae), “Tobacco flea” Epitrix argentinensis (Coleoptera: Chrysomelidae), “Trips” Frankliniella spp. (Thysanoptera: Thripidae), “Aphids” Myzus spp (Hemiptera: Aphididae), “Whiteflies” Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), “Tobaco stem miner” Faustinus cubae (Coleoptera: Curculionidae), “Bollworm complex” which comprises species from the genus Helicoverpa (Lepidoptera: Noctuidae) and Manduca sexta are found. To mitigate the adverse effects produced by traditional agriculture in sustainable manner new approaches had been developed. In this sence, Integrated Pest Management (IPM) constitutes a crop protection system which combines several techniques and that intends to be a long-term strategy and environmental and economically viable. Biological Control (BC) is one of the strategies that IPM programs employ, and utilizes organisms that are naturally present in the environment or not, to reduce plagues density. Entomopathogenic fungi are considered effective BC agents since they are highly specific to insect, disperse naturally, could be in vitro maintained, are not toxic to vertebrates and they could establish in the environment providing a permanent control over pests. Despite previous mentioned facts, when entomopathogenic fungi are utilized under field conditions certain environmental conditions like temperature, humidity and sunlight exposure may affect their effectiveness. The term “endophyte” is utilized to refer to those organisms that inhabit plant tissues during a period of their life cycle without causing apparent harm to their host. Endophytic fungi have been isolated from almost every plant studied and have been found colonizing seeds, stems, leaves and other vegetal tissues and organs. A recent developed tool to improve the effectiveness of the BC exerted by these organisms is the utilization of entomopathogenic fungi as endophytes. Beauveria bassiana (Bals.-Criv.)Vuill., Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokīn, Lecanicillium lecanii (Zimm.) Zare & W. Gams and Paecilomyces farinosus (Holmsk.) A.H.S. Br. & G. Sm have been isolated as natural endophytes of different plant species, while others have been artificially inoculated utilizing different techniques to control insect pests. In agreement with previously mentioned facts, this Doctoral Thesis aimed: 1) to describe natural endophytic communities in Nicotiana tabacum L. plants in Jujuy province, 2) to prospect, detect and isolate native strains of entomopathogenic fungi present in soils and infecting insects, 3) to perform a morphological and molecular description of the strains and their insecticidal capacity to tobacco plagues as well, 4) to evaluate the obtained strains of entomopathogenic fungi capacity to endophytically colonize tobacco plants under laboratory conditions and finally 5) to evaluate feeding deterrence, sub-lethal effects and pathogenicity towards insects fed with plants inoculated with the strain that showed the best endophytic capacity. From sampling performed in Jujuy province, a total of 1588 endophytic fungal strains were isolated from Virginia tobacco plants (variety K394), belonging to the Phyla Ascomycota and Zygomycota. These were assigned to 31 morphospecies; 516 strains were isolated from roots, 504 from stems and 568 from leaves. The Principal Component Analysis performed allowed to establish that most of the isolates were present in only one organ. On the other hand, 20 entomopathogenic fungal strains, 11 belonging to B. bassiana, 8 to P. lilacinum and 1 to M. anisopliae were isolated from soil samples employing the serial dilution technique in selective media. The diversity analysis using ISSR markers showed that B. bassiana and P. lilacinum strains that presented higher pathogenicity towards Helicoverpa gelotopoeon (Lepidoptera: Noctuidae) and D. speciosa (Coleoptera: Chrysomelidae) generated similar band patterns. To evaluate the endophytic capacity of the entomopathogenic fungal strains the foliar spray method was utilized to spray conidial solutions to tobacco plants. The colonization percentage was determined on roots, stems and leaves at 7, 14, 21 and 28 days after inoculation. The B. bassiana LPSC 1215 strain showed the best endophytic capacity among the three organs evaluated. A “choice test” was performed to study the effects of B. bassiana LPSc 1215 as endophyte over feeding deterrence against D. speciosa adults and H. gelotopoeon larvae that were obtained from the field and raised on artificial diet respectively. This strain did not reduced significantly the amount of vegetal material consumed by the insects. The lethal and sub-lethal effects of this strain as endophyte over H. gelotopoeon were also studied. Survival, fertility and larval longevity were negatively affected by the presence of the endophyte, while in adults the generaltional time, ovipositional period, fecundity and fertility were negatively affected as well. Results obtained in the present Doctoral Thesis allow concluding that tha native strain of B. bassiana LPSc 1215 obtained from tobacco grown soil from Jujuy province, could be incorporated as an endophytic control agent for the lepidopteran plague H. gelotopoeon in crop protection programs.