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dc.contributor
Cricco, Julia Alejandra  
dc.contributor.author
Pagura, Lucas  
dc.date.available
2019-09-20T21:39:53Z  
dc.date.issued
2018-03-22  
dc.identifier.citation
Pagura, Lucas; Cricco, Julia Alejandra; Caracterización de la proteína TcHTE y su relación con el transporte de hemo en Trypanosoma cruzi; 22-3-2018  
dc.identifier.uri
http://hdl.handle.net/11336/84041  
dc.description.abstract
Trypanosoma cruzi, el agente causante de la enfermedad de Chagas-Mazza, carece de las enzimas de la vía de síntesis de hemo que está altamente conservada a los largo de la evolución, dando origen a la auxotrofía por esta molécula esencial para los organismos aeróbicos [Koreny, et al., 2010 - Panek y O'Brian, 2002]. Debido a esta deficiencia, T. cruzi debe incorporar este cofactor ya sea del hospedador mamífero o del insecto vector y al mismo tiempo controlar su distribución y concentración intracelular para evitar su toxicidad [Koreny, et al., 2010]. Debido a sus características hidrofóbicas, la carga del ión central y su tamaño, el hemo no podría atravesar libremente las membranas biológicas, por lo que se ha propuesto que deben existir transportadores proteicos dedicados a esta función [Cupello, et al., 2011 - Lara, et al., 2007] que le permitirían al parásito incorporar suficiente hemo para completar su cuota. Si bien se han descripto y caracterizado diversos mecanismos de incorporación de hemo en organismos procariotas [Anzaldi y Skaar, 2010], los mecanismos de transporte en organismos eucariotas no han sido caracterizados en su totalidad, y particularmente en tripanosomátidos, se desconocen cuáles son las proteínas involucradas y cómo funcionan. En este trabajo de tesis nos propusimos entonces, estudiar el proceso de importación del cofactor hemo en los diferentes estadios del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi, analizando su regulación y procurando la identificación de proteínas que cumplan su función en alguna de estas etapas del transporte. Los resultados obtenidos han permitido profundizar el conocimiento general sobre el transporte de hemo en T. cruzi. Hemos avanzado en el estudio de la relación entre el hemo y el estadio de epimastigote analizando los efectos causados por los cambios en la disponibilidad de este cofactor sobre el parásito. Además, mediante la utilización de análogos fluorescentes de hemo (AHs) se logró determinar que el transporte de hemo ocurría solo en los estadios replicativos del parásito. Por otro lado, hemos identificado en el genoma de T. cruzi, una secuencia codificante para una proteína de la familia HRG (debido a su nombre en inglés Heme Responsive Genes), a la cual denominamos TcHTE. Mediante ensayos de complementación heteróloga comprobamos que esta proteína facilita el transporte de hemo en levaduras (de allí su nombre TcHTE por Heme Transport Enhancer) [Merli, et al., 2016]. Además, la expresión de la proteína recombinante como fusión a la proteína verde fluorescente en su extremo C-terminal (TcHTE-HIS-GFP) permitió identificar su localización en la membrana plasmática de las levaduras). En el parásito, la expresión de la proteína recombinante, nos permitió determinar que en epimastigotes y tripomastigotes, la proteína se localiza en la región del bolsillo flagelar [Merli, et al., 2016], mientras que en amastigotes la proteína recombinante se encontraría mayoritariamente en la región del bolsillo flagelar pero también pudo ser detectada en la membrana plasmática. Por otro lado, hemos comprobado que la expresión de la proteína recombinante en epimastigotes favorece la incorporación del cofactor hemo. Hemos diseñado y obtenido anticuerpos policlonales de conejo que reconocen específicamente a TcHTE, los cuales fueron utilizados en distintas técnicas (como Western Blot (WB), Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)) para analizar la acumulación de la proteína endógena en los diferentes estadios del ciclo celular del parásito, y su relación con la importación de hemo. Estos estudios fueron completados con el análisis de los niveles de transcripto de TcHTE, dando resultados concordantes. Tanto la acumulación de la proteína como los niveles de transcripto fueron más abundantes en los estadios replicativos del parásito siendo casi indetectables en el estadio de tripomastigote. Además, en epimastigotes determinamos que tanto la acumulación de la proteína como los niveles de transcripto, varían según la presencia de hemina en el medio de cultivo. A su vez, la utilización de los AHs nos permitió demostrar que el parásito regularía la expresión de la proteína TcHTE en función de la concentración intracelular de porfirinas (hemo y AHs). Mediante diversas técnicas de microscopía, y la utilización de la proteína recombinante TcHTE-HIS-GFP, fuimos capaces de comprobar que el extremo C-terminal se encuentra localizado del lado citosólico de la célula (tanto en el parásito, como en células HEK293-T), tal como había sido predicho para las proteínas de la familia HRG [Huynh, et al., 2012 - Rajagopal, et al., 2008 - Yuan, et al., 2012], siendo la primera vez que se comprueba experimentalmente. Además, los resultados que obtuvimos mediante TIRF-M indican que la proteína se encontraría formando multímeros (trímeros) en la superficie celular, lo que fortalece la hipótesis de que TcHTE forme parte del sistema responsable del transporte de hemo en T. cruzi. En función de los resultados obtenidos, podemos concluir que T. cruzi solo incorpora hemo en los estadios replicativos, mediante la expresión de un complejo proteico en el bolsillo flagelar, que involucraría la participación de trímeros de TcHTE. Si bien la regulación de la expresión del complejo es incierta, ésta respondería a la concentración y disponibilidad de hemo intracelular, permitiendo la incorporación del cofactor solo cuando es necesario, evitando así los efectos tóxicos de un exceso de hemo libre. Completar la elucidación de esta vía, identificando otras proteínas que participen en el proceso, y estableciendo los mecanismos de regulación, permitirían identificar nuevos blancos moleculares que puedan ser utilizados como estrategias para la inhibición de la proliferación de T. cruzi.  
dc.format
application/pdf  
dc.language.iso
spa  
dc.rights
info:eu-repo/semantics/openAccess  
dc.rights.uri
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar/  
dc.subject
Trypanosoma  
dc.subject
Hemo  
dc.subject
Transporte  
dc.subject
Chagas  
dc.subject.classification
Bioquímica y Biología Molecular  
dc.subject.classification
Ciencias Biológicas  
dc.subject.classification
CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS  
dc.title
Caracterización de la proteína TcHTE y su relación con el transporte de hemo en Trypanosoma cruzi  
dc.type
info:eu-repo/semantics/doctoralThesis  
dc.type
info:eu-repo/semantics/publishedVersion  
dc.type
info:ar-repo/semantics/tesis doctoral  
dc.date.updated
2019-09-17T13:48:35Z  
dc.description.fil
Fil: Pagura, Lucas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina  
dc.relation.alternativeid
info:eu-repo/semantics/altIdentifier/url/https://rephip.unr.edu.ar/handle/2133/15731  
dc.conicet.grado
Universitario de posgrado/doctorado  
dc.conicet.titulo
Doctor en Ciencias Biológicas  
dc.conicet.rol
Autor  
dc.conicet.rol
Director  
dc.conicet.otorgante
Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas