Señalización a través de AMPc-EPAC y expresión de MCAM en la diferenciación de fibroblastos 3T3-L1 a adipocitos

Abstract

La obesidad se debe a un aumento en el número y tamaño de adipocitos. Dada su prevalencia en la población y la variedad de patologías asociadas a ella, este trabajo pretende contribuir a dilucidar los eventos moleculares que participan en la formación de nuevos adipocitos a partir de células precursoras. Se utilizó la línea celular de fibroblastos 3T3-L1, los cuales se diferencian a adipocitos por agregado de una mezcla que contiene insulina, dexametasona y metilisobutilxantina (MIX). MIX aumenta la concentración intracelular de AMPc. EPAC es una proteína activada por AMPc que hemos demostrado que está involucrada en este proceso de diferenciación. Continuando esta línea de investigación, en este trabajo se encontró que la señalización a través de AMPc-EPAC participa en la activación de genes importantes para la adipogénesis y asociados al fenotipo correspondiente al adipocito, como C/EBPβ y PPARγ. Por otro lado, mediante un análisis de microarray se identificaron varios genes cuya expresión varía durante este proceso, algunos de los cuales requieren la presencia de AMPc. A partir de este análisis, nos interesó identificar nuevos genes importantes en la adipogénesis y analizar su dependencia del aumento de AMPc. Se comenzó investigando un gen que aumentó su expresión durante este proceso: MCAM o CD146, que pertenece a la familia de moléculas de adhesión celular y que también ha sido relacionado con procesos de diferenciación de células precursoras mesenquimales. Hemos observado que los niveles del mRNA de MCAM aumentan durante el proceso de diferenciación de fibroblastos 3T3-L1. Este aumento es posterior al de PPARγ y se incrementa en presencia de pioglitazona, que es un activador de PPARγ. Por otro lado, el bloqueo de la expresión de MCAM por RNAi produjo una inhibición de la adipogénesis, asociada a una menor expresión de PPARγ y otros genes específicos del adipocito. Estos estudios nos han permitido evaluar la importancia de la señalización a través de EPAC y el requerimiento del aumento de MCAM en la diferenciación de fibroblastos 3T3-L1 a adipocitos. De este modo se pretende contribuir a comprender los mecanismos involucrados en la adipogénesis, lo que podría mejorar la capacidad de desarrollar nuevas terapias para el tratamiento de la obesidad.

Obesity is a complex disease characterized by an increase in the number and size of adipocytes. Due to its prevalence in the population and the variety of associated pathologies, the aim of the present study is to contribute to elucidate the molecular events that participate in the formation of new adipocytes from precursor cells. We used the 3T3-L1 fibroblasts cell line model, which is induced to differentiate to adipocytes by the addition of a mixture containing insulin, dexamethasone and methylisobutylxanthine (MIX). MIX increases the intracellular concentration of cAMP and EPAC is a protein activated by cAMP. We have previously demonstrated that EPAC is involved in the differentiation of 3T3-L1 fibroblasts. In keeping with this, in the present investigation, we found that cAMP-EPAC signaling is involved in the activation of genes important for adipogenesis and associated to the adipocyte phenotype, like C/EBPβ and PPARγ. In addition, many genes whose expression changes during this process were identified by microarray analysis, some of them require the presence of cAMP. We are interested in the identification of novel genes important for adipogenesis and in the analysis of their dependence on the increase of cAMP. We started studying a gene upreglulated during adipogenesis: MCAM/CD146, which belongs to the family of cell adhesion molecules and has been shown to be involved in differentiation processes of mesenchymal precursor cells. We observed that MCAM mRNA levels increased during the differentiation of 3T3-L1 fibroblasts. This increase was preceded by PPARγ upregulation and was enhanced by pioglitazone, which is an activator of PPARγ. On the other hand, MCAM knockdown by RNAi inhibited adipogenesis and impaired the expression of PPARγ and other adipocyte-related genes. Our results highlight the importance of EPAC signaling and the requirement of MCAM expression in the differentiation of 3T3-L1 fibroblasts to adipocytes. This further contributes to understand the mechanisms involved in adipogenesis, which may improve our ability to develop new therapies for the treatment of obesity.