Análisis del impacto de glifosato sobre comunidades microbianas de suelos de la región pampeana mediante un enfoque fisiológico y molecular

Abstract

La intensificación agrícola característica de los últimos tiempos, tanto en Argentina como a nivel mundial, depende en gran medida de la utilización de herbicidas para el control de malezas en cultivos y pasturas. El glifosato [N-(fosfonometil)glicina] es el herbicida más utilizado en el mundo en la actualidad. Es un herbicida de amplio espectro, no selectivo, usado en pre-siembra o post-emergencia, cuyo consumo se incrementó impulsado por la difusión de los cultivos genéticamente modificados resistentes al principio activo (GR) y la expansión de la agricultura en siembra directa. Asimismo, es utilizado también como agente de desecación química en cultivos sensibles, por ejemplo, para la supresión de cultivos de cobertura. La potencial alteración de las comunidades microbianas y los procesos biológicos del suelo por el glifosato ha despertado un particular interés ya que las comunidades microbianas edáficas llevan a cabo importantes funciones en el ecosistema. El objetivo de esta Tesis Doctoral fue evaluar el impacto de glifosato en comunidades microbianas del suelo. Para ello, se llevaron a cabo diferentes experimentos desde un enfoque tanto fisiológico como molecular. En primera instancia, en un estudio de carácter observacional, se determinó si la exposición crónica al herbicida puede conducir a un incremento en la tolerancia de la comunidad. Los resultados de la estrategia ecotoxicológica PICT (Pollution Induced Community Tolerance), con el ingrediente activo (IA) y con un formulado comercial (FC), indicaron que las comunidades microbianas de suelos con larga historia de exposición a campo (H) no presentan una mayor tolerancia respecto de aquellas presentes en suelos sin historia (NH). La tolerancia no incrementada fue consistente con un estudio posterior en microcosmos en el cual no se observó un fenómeno de ?costo de tolerancia? frente a un disturbio secundario (desecación-humedecimiento). El efecto de un ciclo de desecación-humedecimiento sobre un indicador de estrés metabólico (cociente respiratorio, RQ), no fue significativo en el sitio H ni en el sitio NH. Asimismo, se demostró que en el sitio H la abundancia de genes indicadores de diferentes grupos microbianos, entre ellos bacterias totales, Actinobacteria, bacterias y arqueas oxidantes del amoníaco (BOA y AOA, respectivamente), en respuesta al disturbio mencionado, no se encuentra condicionada por la presencia/ausencia de una aplicación previa de glifosato. Sin embargo, en un experimento en microcosmos se observó que aplicaciones repetidas de glifosato conducen a modificaciones fisiológicas y a nivel de estructura de la comunidad. El RQ, con ácido p-cumárico como sustrato, se incrementó luego de tres aplicaciones del ingrediente activo (IA) respecto del control, tanto en sitios H como NH, indicando una condición de estrés metabólico y un posible impacto sobre microorganismos capaces de catabolizar fenilpropanoides. El FC, a diferencia del IA, mostró mayores efectos a nivel de estructura de la comunidad de BOA. En una de las dos localidades estudiadas, los perfiles basados en ADN de este grupo específico de microorganismos, indicaron una menor similitud de microcosmos con tres aplicaciones del FC respecto de microcosmos control, tanto para el sitio H como el NH, no observada con el IA. De la misma manera, en ambos sitios se observaron modificaciones en la abundancia relativa de BOA. Finalmente, se estudiaron las comunidades microbianas rizosféricas de Avena sativa L., especie utilizada frecuentemente como cultivo de cobertura (CC) y tratada con glifosato durante la etapa de finalización del cultivo. Se observaron efectos diferenciales de la desecación con un FC de glifosato, respecto de un método sin herbicida (corte). Si bien la estructura de la comunidad bacteriana (diversidad α y β) no mostró un efecto significativo del método de finalización, se detectaron diferencias en los perfiles catabólicos de las comunidades (CLPP) como así también en la diversidad catabólica y en la abundancia relativa de ciertos grupos bacterianos, entre ellos, las BOA. A los 26 días post-tratamiento, la diversidad catabólica observada fue mayor en el método con glifosato y los perfiles fisiológicos se diferenciaron significativamente, con una utilización mayor de todos los sustratos carbonados evaluados. Además, la rizosfera de plantas secadas con glifosato presentó una menor abundancia de AOA, una mayor abundancia relativa del OTU 35 (Mesorhizobium sp., posiblemente involucrada en la degradación de fosfonatos), y se detectaron plásmidos promiscuos IncP-1 ε, no observados en ausencia de glifosato. Un mecanismo putativo de impacto de glifosato basado en la exudación incrementada de compuestos fenólicos inhibitorios explicaría la menor abundancia de AOA y de BOA, mientras que la exudación directa de glifosato, reportada en diversos estudios, sería la causa del incremento de bacterias degradadoras de fosfonatos. Los resultados obtenidos mediante la estrategia PICT, apoyados por la ausencia de un fenómeno de ?costo de tolerancia? frente a un disturbio secundario (desecación-humedecimiento), permiten concluir que la exposición crónica de las comunidades microbianas a glifosato no conduce a un incremento en la tolerancia. Sin embargo, la ausencia de una respuesta PICT es insuficiente para concluir que no han ocurrido modificaciones en la comunidad. Las evidencias obtenidas a partir del estudio de impacto de aplicaciones repetidas en microcosmos sugieren que podrían existir modificaciones en grupos específicos de microorganismos, entre ellos, las BOA, un grupo clave en el ciclo del N. La estrategia PICT podría ser sensible a grandes cambios en la comunidad pero insensible a poblaciones especializadas dentro de la misma. Por tal motivo es necesario considerar también indicadores relacionados con grupos específicos y ecológicamente relevantes para una evaluación precisa y abarcativa de los efectos del herbicida. Asimismo, es necesario incluir a la microbiota rizosférica en las evaluaciones de impacto. Las diferencias observadas entre comunidades microbianas rizosféricas de plantas de A. sativa finalizadas por desecación o corte, a los 26 días post-tratamiento, podrían derivar en efectos diferenciales sobre el ensamble de comunidades microbianas rizosféricas del cultivo sucesor, aspecto que deberá evaluarse en futuras investigaciones. De la misma manera, el enriquecimiento en bacterias degradadoras de fosfonatos a los 26 días podría estar asociado a una mayor potencial de degradación de glifosato en la rizosfera de plantas tratadas con el herbicida, aspecto que también deberá abordarse en próximos estudios. Finalmente, esta Tesis demuestra, por primera vez, que la abundancia de microorganismos oxidantes del amoníaco (MOA) constituye un indicador sensible frente a un FC de glifosato, tanto en suelo rizosférico como no rizosférico, con el potencial de ser utilizado en programas de monitoreo en el largo plazo. Asimismo, se propone un mecanismo putativo de impacto de glifosato en la rizosfera relacionado con la exudación incrementada de compuestos fenólicos que podría explicar la reducción observada en la abundancia de MOA.

Glyphosate is the most used herbicide worldwide. While contrasting results have been observed related with its impact on soil microbial communities, more studies are necessary to elucidate the potential effects of the herbicide. The objective of this research was to assess the impact of glyphosate on soil microbial communities from Argentinian Pampas soils. An initial observational study was conducted to assess the tolerance to glyphosate of contrasting soils with (H) and without (NH) history of exposure to the herbicide using the ecotoxicological approach Pollution Induced Community Tolerance (PICT). Results from three different locations indicated that tolerance to glyphosate was not higher in H soils than in NH soils either for the active ingredient (AI) or a commercial formulation (CF). The nonincreased tolerance in H soils was consistent with a following research at microcosm level in which no “cost of tolerance” result was observed for the microbial community upon a secondary disturbance frequently detected in the soil environment (dry-rewetting). The effect of a dry-rewetting cycle on a metabolic stress indicator (respiratory quotient, RQ) was not significant in H or NH site. Similarly, when the agricultural H site was assessed by molecular methods, the response of different indicator genes to a dry-rewetting cycle was not conditioned by a previous application of a CF. However, these results should not be considered a strong evidence of no changes in soil microbial communities induced by the herbicide. Further research in soil microcosms revealed changes in the physiology and structure of microbial communities after repeated applications. The RQ with p-coumaric acid was increased after three applications of the AI relative to control microcosms, in H and NH sites, while the relative abundance and structure of AOB was also modified in both sites in one of the two locations assessed, but only under CF exposure. Finally, soil microbial communities from the rhizosphere were included in the study in order to get a more accurate and comprehensive assessment of glyphosate impact. In a greenhouse assay, soil microbial communities from the rhizosphere of a cover crop (Avena sativa L.) suppressed by a nonchemical method (mowing) were compared with communities from glyphosate desiccated plants. Differential effects were observed in catabolic diversity, in the abundance of specific bacterial groups (namely BOA, AOA and Bacilli) or species (Mesorhizobium sp.) as well as in the occurrence of broad host range IncP-1 plasmids. This research demonstrates the applicability of BOA and AOA as indicators of glyphosate impact in different soil environments and proposes a putative model to explain the differential effects of glyphosate and mowing methods on rhizhospheric microbial communities.