Caracterización de nuevos materiales para su aplicación en el aislamiento y purificación de macromoléculas

Abstract

En la actualidad, existe una gran necesidad de desarrollar nuevas herramientas y métodos en el área de la bioseparación. Una de las principales demandas de las industrias alimenticia, textil, papelera, cosmética y farmacéutica, es la disposición de grandes cantidades de enzimas y, en algunos casos, con altos grados de pureza, ya que estas presentan ventajas tanto a nivel velocidad y costo de producción, como así también en el rendimiento del proceso y el bajo impacto negativo en el medio ambiente. Así, surge la búsqueda de nuevas técnicas bioseparativas para la obtención de enzimas. En los últimos años, los procesos de adsorción han sido ampliamente desarrollados para su uso en la recuperación de macromoléculas. Esta técnica hace uso de la capacidad de adsorción de una fase sólida para unir moléculas presentes en una solución. La adsorción puede ser llevada a cabo en tanque agitado, donde el sistema llega a un equilibrio en la concentración de adsorbato tanto en el adsorbente como en la solución; o en columna donde, dependiendo del sentido del flujo de la solución, puede clasificarse como lecho empacado, lecho expandido o fluidizado. El principal problema de esta técnica es que las matrices de adsorción comerciales existentes presentan costos elevados y una vida útil corta, por lo que es deseable diseñar nuevos sistemas rentables y con alta capacidad de adsorción. El uso de polímeros naturales para obtener matrices con capacidad de adsorber proteínas es una excelente opción, ya que son fáciles de preparar, rentables y no contaminantes. En este trabajo se desarrollaron, en una primera parte, matrices de Alginato y Goma Guar, dos polímeros naturales, a partir de la gelificación de una solución de dichos polisacáridos cuando entra en contacto con una solución de CaCl2. Las esferas obtenidas fueron entrecruzadas covalentemente con Epiclorohidrina, con el objetivo de aumentar su estabilidad evitando su disolución. Se caracterizaron morfológica y estructuralmente, verificando su tamaño promedio de 2 mm, su alta hidrofilicidad o capacidad para retener agua y la reacción exitosa entre los grupos OH del Alginato y los grupos epoxi de la Epiclorohidrina a partir del análisis del espectro de Infrarrojo (FT-IR) de las matrices tratadas químicamente. Se estudiaron la cinética y las isotermas de adsorción de la Lisozima en la matriz polimérica. La cinética de adsorción siguió un modelo de pseudo primer orden, mientras que la isoterma de adsorción en el equilibrio pudo representarse mediante el modelo de Freundlich. La cantidad máxima de Lisozima adsorbida en esta matriz fue de aproximadamente 2,4 mg por g de matriz hidratada a pH 7,0. El mecanismo de adsorción se asoció a un proceso de difusión simple con una interacción Coulombica débil entre la proteína y la matriz. La presencia de NaCl 0,3 M indujo un desplazamiento total de la Lisozima desde la matriz. Bajo esta condición, el porcentaje de proteína desorbida fue del 95%. Se realizaron ciclos sucesivos de adsorción-desorción por lavado y los resultados mostraron la reversibilidad del proceso y la utilidad del método para la purificación y separación de enzimas. También, se estudió la adsorción y desorción de Lisozima en lecho empacado utilizando la matriz Alginato-Goma Guar. Se concluyó que los modelos de Thomas y Tiempo de Servicio de la Altura del Lecho ajustaron correctamente a los datos experimentales de las curvas de rupturas con altos coeficientes de correlación. Se llevó a cabo un último paso para la purificación de Lisozima a partir de clara de huevo como fuente natural, obteniéndose un 75% de rendimiento y un factor de purificación de alrededor de 15 cuando se trabajó en columna de lecho empacado. En una segunda parte, se abordó la obtención y caracterización de la matriz de Alginato-Goma Guar entrecruzada con Epiclorohidrina en presencia de diferentes polímeros de cadena flexible: alcohol polivinílico, polivinilpirrolidina y Pluronic® F68. Las matrices obtenidas se usaron para la adsorción de Lisozima y Quimotripsinógeno, y mostraron, para ambas proteínas, una captación creciente en presencia de los polímeros de cadena flexible en el sentido: ninguna < Pluronic® F68 < polivinilpirrolidina < alcohol polivinílico. Se encontró que, en todos los casos, el proceso de adsorción sigue un modelo de cinética de pseudo primer orden y no se encuentra influenciado por el tipo de polímero y que el modelo de Freundlich es el más adecuado para el ajuste de los datos experimentales. Se confirmó que, la adición de alcohol polivinílico y polivinilpirrolidina mostraron la mayor capacidad de adsorción para ambas proteínas comparadas frente a la matriz Alginato-Goma Guar. Esto se debe a un incremento en la rigidez del gel causada por la formación de enlaces puente hidrógeno entre los polisacáridos y los polímeros sintéticos. Finalmente, se obtuvo un recupero de 79% y un factor de purificación de 17 veces de Lisozima desde la clara de huevo en un sistema de lecho empacado con la matriz Alginato-Goma Guar-alcohol polivinílico. Esto verificó que la presencia de este polímero provoca cambios estructurales en la matriz que beneficia la adsorción de macromoléculas desde su fuente natural. Por último, se obtuvieron micropartículas de Alginato mediante secado por pulverización (Spray Drying) y se entrecruzaron químicamente con Epiclorohidrina. Las micropartículas se caracterizaron por su tamaño, morfología superficial (SEM), potencial zeta, análisis térmico (TGA/DSC) y espectroscopia Raman. Las micropartículas resultantes presentaron tamaños promedios de 700 nm y un valor de potencial zeta de -84 mV. La capacidad de adsorción de la matriz se estudió utilizando Lisozima y Quimotripsinógeno como proteínas modelo. Las isotermas de equilibrio fueron descritas por los modelos de Langmuir y Hill, respectivamente. Las capacidades máximas de adsorción para la Lisozima y el Quimotripsinógeno fueron 1880 y 3034 mg/g de micropartículas de Alginato, respectivamente. Finalmente, se estudió la capacidad de selección de las micropartículas de Alginato para ambas proteínas a partir de una mezcla compleja de proteínas. Luego de un ciclo de adsorción, lavado y desorción, se verificó, por SDS-PAGE, la separación de las proteínas modelos con respecto a las proteínas totales presentes en el sistema.