Mecanismos de acción de eritropoyetina y eritropoyetina carbamilada en la funcionalidad de células endoteliales

Abstract

Durante mucho tiempo la Eritropoyetina (Epo) fue conocida únicamente por su acción sobre elsistema hematopoyético. Más recientemente, investigaciones desarrolladas para comprender losmecanismos básicos de sus efectos biológicos han revelado un efecto pleiotrópico de Epo que seextiende más allá de la regulación eritropoyética. En este sentido, su capacidad citoprotectorasugiere un posible uso terapéutico en enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares,además de su administración a pacientes anémicos.Por otro lado, la actividad de Epo sobre progenitores eritroides de médula ósea ha sido asociadaa una mayor incidencia de eventos trombóticos e hipertensión en pacientes, lo cual ha dadoorigen a la búsqueda de compuestos derivados incapaces de estimular la eritropoyesis queconserven su actividad citoprotectora. Uno de estos compuestos es la eritropoyetina modificadapor carbamilación (cEpo), cuyos efectos sobre el endotelio no han sido estudiados enprofundidad hasta el momento.Con el fin de optimizar el uso clínico de Epo se requiere de un mayor conocimiento para aclararla compleja interrelación de las acciones hematopoyética y no-hematopoyética de esta citoquinasobre distintos tejidos. En base a esto, uno de los objetivos de este trabajo de Tesis Doctoral esaportar nuevos datos sobre los efectos y mecanismos de acción de Epo sobre el endotelio, conparticular interés en la angiogénesis, al mismo tiempo que se busca dilucidar si la carbamilaciónde la molécula de Epo introduce algún cambio en su actividad biológica sobre célulasendoteliales.Mediante técnicas de migración por wound healing, formación de túbulos de células endotelialessobre un sustrato símil matriz extracelular y análisis del ciclo celular, realizados sobre la líneacelular endotelial humana EA.hy926, determinamos un efecto inductor de Epo sobre la funciónangiogénica, que no fue observado con cEpo. En cuanto a los mecanismos de accióninvolucrados, hemos descrito la participación del receptor EpoR2 y de la quinasa JAK2, asociadosa la acción eritropoyética de Epo, en su efecto inductor de la migración en células endoteliales. Sibien cEpo fue capaz de activar las vías de señalización asociadas a Epo, su ausencia de efectopromigratorio estaría relacionada con un cierre prematuro de su señal, mediado por la fosfatasaPTP1B. Este mecanismo de acción diferencial entre ambas eritropoyetinas fue reportado entrabajos anteriores de nuestro grupo realizados en células eritroides.Por otro lado, nuestros resultados muestran un efecto dual de Epo sobre la generación deespecies reactivas de oxígeno, siendo capaz de prevenirla a tiempos largos de exposición, al igualResumenque cEpo, pero también estimulándola en forma transiente, lo cual constituiría un mecanismopromigratorio. La enzima óxido nítrico sintasa también estaría relacionada con la acción de Eposobre la migración de células EA.hy926.La relación entre calcio y eritropoyetina, descrita anteriormente en la diferenciación eritroide,también es importante en la migración de células endoteliales, como lo confirman ensayosrealizados con quelantes de este catión. Mediante experimentos realizados con inhibidoresfarmacológicos de canales de calcio dependientes de voltaje se determinó la participación de losmismos en el influjo de este catión estimulado por Epo, lo que constituye una evidencia a favorde la expresión de estos canales en células endoteliales. El estudio de estos canales nos permitió,además, conocer la actividad antiangiogénica de la amlodipina, un antagonista de calcio de usoclínico como antihipertensivo. Por otra parte, también se determinó la importancia de canales decalcio TRPC y canales de potasio en la respuesta migratoria a Epo. El calcio fue también unintermediario en el efecto inductor de Epo sobre la expresión de acuaporina-1, cuya funcióncomo proteína canal de agua hemos visto por primera vez asociada a la migración estimuladapor Epo.En conjunto, los resultados presentados en este trabajo de Tesis muestran un efecto diferencialde eritropoyetina y su derivado carbamilado sobre la angiogénesis, mediante mecanismossimilares a los observados en células eritroides, y aportan información sobre los diferentesintermediarios y efectores de Epo en su modulación de la actividad angiogénica. La incapacidadde cEpo de activar procesos relacionados a la migración celular genera interés en su posibleaplicación terapéutica, ya que podría ejercer citoprotección sin estimular la angiogénesis ni laeritropoyesis en pacientes donde estos procesos pueden representar un efecto indeseado.

For a long time, erythropoietin (Epo) was only recognized for its actions in the hematopoietic system. More recently, research aimed at understanding the basic mechanisms of its biological effect has revealed a pleiotropic cytoprotective activity of Epo beyond the regulation of erythropoiesis. These findings have placed Epo as a compound of therapeutical interest in neurodegenerative and cardiovascular ailments, apart from the treatment of anemia. On the other hand, the activity of Epo on bone marrow erythroid progenitors has been associated to a greater incidence of thrombotic events and hypertension in patients, which has prompted researchers to find derivatives of Epo incapable of erythropoiesis but with a cytoprotective action. One such compound is carbamylated erythropoietin (cEpo), the effects of which are still largely unknown in endothelial cells. With the aim of optimizing the clinical use of Epo, further knowledge is required to clarify the complex relationship between the hematopoietic and the non-hematopoietic actions of this cytokine in different tissues. Stemming from this, one of the purposes of this Thesis has been to provide further information on the effects and action mechanisms of Epo in endothelial cells, with particular interest in the angiogenic function, as well as to determine if carbamylation of the Epo molecule could introduce modifications in its biological activity in this cell type. The use of different techniques to study the many aspects of angiogenesis, such as cell migration through wound healing assays, cell cycle analysis and tube formation on an extracellular-matrixlike substrate, allowed us to detect a stimulatory effect of Epo on the EA.hy926 endothelial cell line, which was not matched by cEpo. Among the underlying mechanisms, we have described the participation of the EpoR2 receptor and of JAK2 kinase, both associated to the erythropoietic action of Epo, in the promigratory effect of this cytokine. Although cEpo was able to activate the same signalling pathways of Epo, its lack of effect on cell migration could be related to a premature termination of its signal, mediated by the phosphatase PTP1B. This mechanism was also reported in previous works performed by our group on erythroid cells. Our results further show a dual effect of Epo on the generation of reactive oxygen species, being capable of preventing it at long incubation times, but with a transient stimulating effect at shorter exposures, which could represent a promigratory mechanism. The endothelial nitric oxide synthase may also be related to the action of Epo on endothelial cell migration. The relationship between calcium and Epo, previously described in erythroid differentiation, also plays a key role on endothelial cell migration, as confirmed in experiments performed with calcium chelating agents. Assays carried out with pharmacological inhibitors of voltagedependent calcium channels allowed us to determine the involvement of this type of channels in Epo-induced calcium influx, thus supporting their much-debated expression in endothelial cells. The study of these channels allowed us to test the antiangiogenic properties of amlodipine, a calcium antagonist used in the clinic as an antihypertensive compound. On the other hand, we have also determined the participation of TRPC calcium channels and potassium channels in the migratory response to Epo. In addition, we reported for the first time the ability of Epo to increase the expression of aquaporin-1, a water channel involved in the promigratory activity of the cytokine, and the role of calcium as a mediator of such effect. Taken together, the results presented in this Thesis show a differential effect of erythropoietin and its carbamylated derivative on angiogenesis, through action mechanisms similar to those reported in erythroid cells. This work also provides information regarding different mediators and effectors of Epo in endothelial cells. The incapacity of cEpo to activate processes related to endothelial cell migration hints at possible therapeutical applications, since it could exert cytoprotection without stimulating red blood cell production or angiogenesis.