Método de tipificación de DNA a partir de muestras de orina: su utilidad en la resolución de casos de doping positivo en equinos

Abstract

El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un método de extracción de DNA a partir de muestras de orina de caballos, que permita verificar la correspondencia entre la muestra de orina y el animal problema en casos de doping positivos. De esta forma se podrá determinar: (i) la especie de origen de la muestra y (ii) su identidad. Para tal fin, se obtuvieron muestras de orina (evidencia: muestra primaria y muestra testigo) y sangre (referencia) de caballos de carrera del hipódromo de La Plata y del Hospital Escuela de la Facultad de Ciencias Veterinarias (Universidad Nacional de La Plata). A partir del DNA total se tipificaron cinco microsatélites y el gen mitocondrial citocromo-b mediante los métodos de PCR-geles de secuenciación y PCR-RFLP, respectivamente. Los resultados obtenidos evidenciaron que la técnica desarrollada permitió obtener DNA periciable de todas las muestras. El análisis de los patrones de restricción del gen mitocondrial citocromo-b se correspondió con los patrones esperados para Equus caballus. Además, la comparación de los genotipos obtenidos en la tipificación de los microsatélites, permitió asignar cada muestra de orina a su correspondiente muestra de sangre. Por lo tanto, esta técnica permitiría determinar la especie de origen de la muestra y su identidad, siendo de utilidad para resolver las dudas sobre el origen de las muestras en casos de doping positivos en caballos de carrera.

This study was undertaken to develop a DNA isolation method from equine urine samples in order to determine in doping positive cases: (i) the species determination and (ii) the individual identification of the sample. To do this we used urine (evidence: proof and second proof) and blood (reference) samples from horses taken from La Plata hippodrome and the Hospital School of the Veterinary Sciences Faculty (UNLP). Five microsatellites and the mitochondrial b-cytochrome gene were typed using the PCR-STR and PCR-RFLP methods respectively. The results confirmed that the DNA purified by this method satisfied the need for PCR analysis. The mitochondrial cytochrome-b gene PCR-RFLP patterns matched those Equus caballus. Furthermore, comparison between the microsatellite genotypes permitted to assign each urine sample with its corresponding blood sample. In conclusion, the proposed method allowed the species determination and the individual identification of the sample in positive doping cases in racing horses.