Interacción de Brucella con el hospedador: adhesión y biogénesis de la envoltura celular

Abstract

Las bacterias del género Brucella son organismos Gram negativos, patógenos intracelulares facultativos responsables de una zoonosis denominada Brucelosis. La envoltura de Brucella exhibe características únicas que hacen que estas bacterias sean patógenos furtivos y resistentes a compuestos de defensa del hospedador. Brucella se caracteriza por presentar tropismo a diversos tejidos y es capaz de replicar en múltiples tipos celulares. Previo a la invasión la bacteria debe ser capaz de adherirse a la célula hospedadora. Mediante estudios filogenéticos en B. suis 1330 se identificaron diversas proteínas que podrían cumplir una función en la adhesión al hospedador. Dentro de éstas, BmaA y BmaB pertenecen a la familia de autotransportadores (AT) monoméricos. Análisis bioinformáticos de los ortólogos de BmaA y BmaB en los genomas de numerosas cepas de B. suis, Brucella abortus y Brucella melitensis mostraron gran variabilidad. Más aún, BmaA y BmaB serían pseudogenes en varias cepas de B. abortus y B. melitensis, indicando que estas adhesinas contribuirían a la preferencia de hospedador o al tropismo a determinados tejidos. Se demostró que BmaA y BmaB en B. suis son proteínas funcionales que participan en la adhesión a distintos tipos celulares y a componentes de la matriz extracelular del hospedador. Por inmunofluorescencia se observó que BmaB se localiza en el polo nuevo generado luego de la división asimétrica de Brucella, apoyando la hipótesis que en Brucella dicho polo estaría funcionalmente diferenciado para la adhesión. Otro de los candidatos estudiados, denominado MapB, no tuvo función de adhesina, sino que cumpliría un rol crucial en la integridad de la envoltura celular. En efecto, la resistencia típica de Brucella tanto a la lisozima como a polimixina B se redujo marcadamente en la mutante ΔmapB. MapB resultó ser un homólogo lejano de TamB. Esta proteína junto con TamA forman un complejo que participaría en la translocación de ATs a través de la ME. En línea con esta observación, MapB fue requerida para el ensamblaje en la ME de BmaB, ya que la mayor parte del AT se acumuló en el periplasma de ΔmapB. La evaluación de otras proteínas de ME (OMPs) indicó que la ausencia de MapB no condujo a una alteración generalizada de OMPs, sino a una reducción en la abundancia de un subconjunto de OMPs, incluyendo miembros de la familia Omp25/31. Mediante microscopía electrónica se observó que las células ΔmapB presentan anomalías en la morfología celular, lo que indica que la ausencia de MapB altera la división celular. Finalmente, las células ΔmapB mostraron estar comprometidas en la invasión o supervivencia inicial en macrófagos y un fenotipo de virulencia atenuado en el modelo murino. En conjunto, nuestros resultados indican que el rol de MapB no se limita a la translocación e inserción de algunas proteínas en la ME, sino que es esencial para la estabilidad de la ME y participa en la biogénesis de la envoltura celular, un proceso que está inherentemente coordinado con la división celular.

Bacteria of the genus Brucella are gram-negative, facultative, intracellular pathogens responsible for a zoonosis called Brucellosis. Brucella´s cell envelope exhibits unique characteristics that make these bacteria furtive pathogens and resistant to various host defense compounds. Brucella is characterized by its tropism to various tissues and is capable of replicating in several cell types. Before invasion the bacterium must be able to adhere to the host cell. Through phylogenetic studies in B. suis 1330, several proteins that could play a role in host adhesion were identified. From these candidate proteins, BmaA and BmaB were found to belong to the family of monomeric autotransporters (AT). Bioinformatic analyzes of BmaA and BmaB orthologs in the genomes of numerous strains of B. suis, Brucella abortus and Brucella melitensis showed great variability. Moreover, BmaA and BmaB would be pseudogenes in several strains of B. abortus and B. melitensis, indicating that these adhesins would contribute to host preference or tropism to certain tissues. It was demonstrated that BmaA and BmaB in B. suis are functional proteins that participate in the adhesion to different cell types and components of the host extracellular matrix. Additionally, BmaB was detected by immunofluorescence at the new pole generated after the asymmetric division of Brucella. This observation supports the hipothesis that in Brucella this pole would be functionally differentiated for adhesion. Another of the candidates studied, called MapB, did not show adhesin function, but appeared to be crucial for cell envelope integrity. Indeed, the typical resistance of Brucella to both lysozyme and polymyxin B was markedly reduced in the ΔmapB mutant. MapB turned out to represent a TamB ortholog. This last protein, together with TamA, a protein belonging to the Omp85 family, form a complex that has been proposed to participate in the translocation of AT proteins through the outer membrane (OM). Accordingly, it was observed that MapB is required for the proper assembly of BmaB in the OM, as most of the AT accumulated in the mutant cell periplasm. Both assessment of the relative amounts of other specific outer membrane proteins (OMPs) and a proteomic approach indicated that the absence of MapB did not lead to an extensive alteration in OMP abundance, but to a reduction in the relative amounts of a protein subset, including proteins from the Omp25/31 family. Electron microscopy revealed that ∆mapB cells exhibit multiple anomalies in cell morphology, indicating that the absence of the TamB homologue in B. suis severely affects cell division. Finally, ∆mapB cells were impaired in macrophage infection and showed an attenuated virulence phenotype in the mouse model. Collectively, our results indicate that the role of B. suis TamB homologue is not restricted to participate in the translocation of ATs across the OM but that it is essential for OM stability and protein composition and that it is involved in cell envelope biogenesis, a process that is inherently coordinated with cell division.